Name: flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

Cairn araştırma özellikle Mark Henson, Jeremy Graham ve Joao Correia bu sistemi geliştirmek için bizimle çalışmak için teşekkür etmek istiyorum. Biz de David Welsh ve bayram Reddy Peter Laskey (eski adı, Hamamatsu) yanı sıra tasarım aşaması sırasında değerli tartışma için kritik onun girişi el yazması için bir demo kamera ve David Wong kredi düzenlenmesi için teşekkür ederim.

<ol>
	<li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa.">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li><li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants.">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li><li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro.">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li><li>Yoo, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Buhr, D. E., Yoo, S. -. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators.">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li><li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks.">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li><li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling.">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li><li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts.">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li><li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection.">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres, ., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells.">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta.">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li><li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+(+CK1+)+enzymes.">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li><li>Khabirova, E., Chen, K. -. F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flyglow:+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer's+model.">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759 (2016).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışması adlı biri yok.

Burada açıklanan memeli hücre kültürü, derin ve statik koşullarda her ikisi de iletişim kuralıdır. Ancak, timsah kolayca diğer sistemleri modellemek için adapte edilebilir. Gerçekten, o zaten aynı anda hareket, uyku ve sürekli karanlık15altında. tutulan Drosophila melanogaster periferik gen ifade ritimler izlemek için mükemmel bir platform sağlamaktadır gösterilmiştir Ayrıca uygulamaya bağlı olarak, burada açıklanan dışındaki kamera türleri uygun olabileceğini kaydetti. Biz uygun filtreleriyle, geçerli ayarı değiştirilmiş bir sürümü prensipte Floresans miktar için kullanılan olabileceğini öngörmektedir.
Özellikle yüksek Uzaysal çözünürlük görüntüleme memeli dilim organotypic PER2::LUC ifadede kronolojik zamanmekansal organizasyon gibi gerekli olduğu için timsah uygun olmayabilir uygulamalar yalnızca bunlar suprachiasmatic çekirdeği, ya da diğer küçük dokusu dilimlerin.
Timsah şimdiye kadar geleneksel kayıt teknikleri tarafından kolayca ulaşılabilir olmamıştır gerçekleştirilecek birçok deney sağlar. Bioluminescence ölçümü için geçerli yöntemleri ile karşılaştırıldığında, timsah her iki tip hücre kültür çanak veya kullanılabilir slayt, dış ortam koşulları, duyarlılık ve processivity düzeyde esneklik sağlar.
Bu özellikle ilgili bir anda ne zaman standart 2D hücre kültür modelleri 3D organoid ve akış kültür sistemleri doğru uzak dur. Bu nedenle, timsah bioluminescence hangi birçok gün ve hafta çok çeşitli koşullar altında üzerinde ölçülebilir uyarlanabilir bir yöntem sağlayacaktır tahmin edilmektedir.

Luciferases gazetecilere gen ekspresyonu ve protein etkinliği olarak kullanımı moleküler ve hücre biyolojisi araştırmalarında popüler bir teknik haline gelmiştir. Bu ateş böceği luciferase sentezi ve katalitik inactivation Kinetik nerede üzerinden yaklaşık 24 s sirkadiyen döngüsü meydana gen ekspresyonu boyuna değişimler raporlama için özellikle uygundur sirkadiyen alanında geçerlidir. Bu nedenle, luciferase Mantarlar, bitkiler, sinekler ve memeliler1,2,3,4da dahil geniş bir aralığında sirkadiyen muhabir olarak istihdam edilmektedir.
Sirkadiyen gen ifade vitromiktarının, bir photomultiplier tüp (PMT) yaygın olarak kollarındaki sinyal kaydetmek için kullanılır. Devresel_ödeme tabanlı ölçümleri esneklik ancak, genellikle önceden belirlenmiş bir tabak ya da çanak boyutu sınırlı sınırlı olabilir. Ayrıca luciferase ifadede mekansal varyasyon gösteren örnekleri Imaging bilgi kaybına yol açabilir bir Devresel ödeme kullanarak izlenen örnekleri kayma herhangi bir bilgi toplamak mümkün değildir. Ayrıca, devresel_ödeme ve ilişkili elektronik oksijen Standart hücre kültür kuluçka ortamına maruz kaldığında arıza eğilimli olduğundan, boyuna luciferase kayıt PMTs kullanarak her zaman sigara nemlendirilmelidir İnkübatörler içinde gerçekleştirilir. Sonuç olarak, hücre kültürü yemekleri gerekir kapalı hava-buharlaşma yoluyla nem kaybını önlemek için sıkı ve kültür medya bu nedenle 3 - ile tamponlanmış olmalıdır (N- morpholino) propanesulfonic asit (paspas) veya 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic asit (HEPES), in vivo fonksiyonları ve memeli doku kültüründe rutin olarak kullanılan sistem tampon CO2/bicarbonate yerine.
Bu sınırlamalar bir sonucu olarak PMTs tarafından bioluminescence ölçümü genellikle sıkı kısıtlamalar altında hücreler deneyler sırasında korunur koşulları üzerine yerleştirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için ve aynı zamanda olası deneysel koşullar aralığı artırmak için biz bir su soğutulmuş elektron-çarparak eklenmesi tarafından uyarlanmış bir standart CO2/n2 170 L doku kültürü kuluçka makinesi kullanın Anti-sis optik ve dijital kontrol sıcaklık ve gaz düzeyleri ile şarj kuplajlı cihaz (EMCCD) kamera. Bu bir otomatik boyuna Luciferase gaz görüntüleme ve Temperature-Optimized kaydedici ya da timsah dönüşmüş bulunuyor. Kollarındaki görüntüleme, standart doku kültürü plakaların yüksek üretilen iş görüntüleme için her ikisi de önemli ölçüde artan esneklik için timsah sağlar (6 x 96 - veya 384-da kadar tabaklar aynı anda) ve standart dışı doku kültürü sistemleri, için de böyle derin hücreler olarak mikrosıvısal aygıt içinde büyüdü. Bu araç aynı zamanda oksijen koşullar altında ve değişken kontrolünü hem CO2 O2 kısmi basınç ve sıcaklık ile gerçekleşmesi için görüntüleme için sağlar.
İletişim kuralı aşağıdaki memeli hücre ve doku kültürü sistemleri (bundan böyle 'bioluminescence kuluçka' adlandırılır) bir timsah kullanarak kollarındaki kayıt için bir yöntemi açıklar. Bu, ancak, sistem kollarındaki görüntüleme ve aynı zamanda, bazı değişiklik, Floresan, diğer biyolojik sistemleri ve bağlamlarda bir dizi Imaging ile uygun olması gerekmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hyclone FetalClone III Serum</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>SH30109.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:145px;">Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Catalase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutathione</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superoxide Dismutase</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Holo-transferrin</td>
			<td style="width:145px;">Calbiochem</td>
			<td>616424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T3 (triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Carnitine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C7518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D (+)-Galactose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Putrescine</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Selenite</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corticosterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linoleic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linolenic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipoic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol Acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinol, all trans</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>95240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D,L-alpha-Tocopherol acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>T3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate Solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GlutaMAX (100x)</td>
			<td style="width:145px;">Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galaxy 170R incubator&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">CO17301001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin</td>
			<td style="width:145px;">Biosynth</td>
			<td style="width:119px;">L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D -(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MOPS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHG0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mm I.D. silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td>19-4692-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elbow luer connector</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Male luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Female luer fittings</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-slide luer I 0.6</td>
			<td style="width:145px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD plastipak 20ml syringe</td>
			<td style="width:145px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1mm I.D. ETFE tubing</td>
			<td style="width:145px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">18-1142-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PF670462</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SML0795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iXon Ultra EMCCD camera</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">iXon 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fiji</td>
			<td style="width:145px;">ImageJ</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism 7.0</td>
			<td style="width:145px;">Graphpad Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deltaphase Isothermal Pad</td>
			<td style="width:145px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated neutral density filter&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">300 mOsmol/kg calibration standard</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Measuring vessel</td>
			<td style="width:145px;">Gonotech</td>
			<td style="width:119px;">30.9.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Focusing cylinder</td>
			<td style="width:145px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:119px;">Custom item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NE-1600 programmable syringe pump</td>
			<td style="width:145px;">Pump Systems inc.</td>
			<td style="width:119px;">NE-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andor Solis Software</td>
			<td style="width:145px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flexible measurement of bioluminescent reporters using an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (alligator)

Luciferase tabanlı gazetecilere hücresel gen ifadesinin boyuna her ikisi için yaygın kullanılmayan ve biyolojik aktivitesini son nokta deneyleri. Sirkadiyen ritim araştırmada, örneğin, saat gen füzyon ile ateş böceği luciferase neden için sağlam ritimler birçok gün içinde kalıcı hücresel bioluminescence içinde olmaktadır. Teknik sınırlamalar photomultiplier tüp (PMT) ile ilişkili veya geleneksel mikroskobu tabanlı yöntemler bioluminescence miktar için genellikle hücre ve dokuların sırasında oldukça fizyolojik koşullarda muhafaza edilmesi talep var. kayıt, duyarlılık ve işlem hacmi arasında bir denge ile. Burada, uzun vadeli bioluminescence görüntüleme yüksek hassasiyet ve hangi kültür koşullar, değişken gaz ve nem kontrolü de dahil olmak üzere geniş bir dizi çekmek ve bu birçok kabul eden işlem hacmi ile farklı sağlar bir arıtma önceki yöntemlerden raporu doku kültürü tabak ve yemekler. Bu otomatik boyuna luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) ayrıca Imaging mekansal varyasyon gözlem luciferase ifadede hücre monolayer veya kolayca geleneksel tarafından gözlenen cant doku üzerinden sağlar yöntemleri. Biz nasıl timsah varolan yöntemleri ile karşılaştırıldığında luciferase aktivite tespiti için büyük ölçüde artan esneklik sağlar vurgulayın.

Bu makalede bir timsah (bioluminescence kuluçka) kullanarak memeli hücrelerinin kollarındaki görüntüleme için bir protokol özetlenmektedir. Bu teknik görüntüleme kollarındaki sistemleri zaman için fiziksel kurulum ve ekstraselüler koşullara esneklik sağlar. Basit statik doku kültürü (şekil 1, ek Video 1) ve derin hücre kültürü (Şekil 2, ek Video 2) yöntemleri açıklanan, ama birçok diğer kurulumları bu sistemi kullanarak yansıma. Tüm veri Bölüm 7'de açıklanan yöntemleri kullanarak sayısal.
Şekil 1A PER2::LUC fibroblastlar4içeren 6 x 96-şey plakalar kayıt bioluminescence video gösterilmektedir. Bunlar bu deneme için gerekli değildi olarak en dıştaki wells hücreleri içermez. Hücreleri farklı sıcaklık sürüklenme, mademki 12 h 37 ° C 72 h veya converse (37 ° c 32 ° c 72 h 12 h ardından 12 h), ardından 32 ° C'de 12 h her iki sıcaklık döngüsünü geçmesi kayıt için sürekli 37 ° C'de tutulan önce geçmiştir. 60 dk Etkilenmeler her saat çekildi. Bu koşullar iki şekil 1Badımında sayısal.
Şekil 2A derin doku kültürü için bir sistemi kurulumunun şematik gösterir. Bu boru ile bağlı iki kanal slayt oluşur. Medya hücreler arasında bir enjektör pompası tarafından tahrik edilmektedir. Bu slaytları ilk gaz geçirgen kabarcık tuzak (arabellek slayt) olarak işlem görür ve ikinci ile hiçbir hücre içerir bioluminescence kaydedilir hücreleri içeren. Bu sistem video kaydı bir temsilcisi şekil 2Biçinde gösterilir. 15 dk Etkilenmeler her 15 dakikada çekildi. Burada, hücreleri standart perfüzyon koşullar altında veya kazein kinaz inhibitörü daha önce sirkadiyen süresini uzatmak ve kültürlü saat gen ifade ritimler genliğini azaltmak için gösterilmiştir PF670462 huzurunda korunur memeli hücre14. PER2::LUC ifade etkisi şekil 2C içinde (üst panel) uyuşturucu şekil 2C içinde (alt paneli), gösterilen standart statik hücre kültür koşullar altında aynı konsantrasyonu ile dönemin miktar ile tedavi hücrelere karşı gösterilen şekil 2Bolarak gösterilir. Bu net PF670462 ile tedavi PER2::LUC ifadesi altında her iki koşul kümesinden birini etkiler bu. Hücreleri periosteum koşulları Haritayı dönem yaklaşık 3 h (3 ±0.9 h) uzatma altında PF670462 ile tedavi ederken, ancak, hücreleri statik koşullarda ilaç ile tedavi daha fazla dönem için bir süre uzatma gösterir &#62; 48 saat. Bu damped kosinüs tarafından Bölüm 7'de açıklandığı gibi uygun olabilir (ekstra toplamı, kareler F test karşı düz bir çizgi, p &#60; 0.0001). İlginçtir, dönem perfüzyon altında uzatma büyüklüğü Bu vivo içinde14gözlenen çok daha yakın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Şekil 1: veri örneği. (A)örnek bioluminescence ölümsüzleştirdi PER2::LUC 6 x 96 dan video görüntüsünü de bioluminescence kuluçka makinesine tabaklar. Kuyu sayısal için tamamlayıcı Video 1sarı vurgulu olarak gösterilmiştir. (B) miktar bioluminescence A. üzerinden İki setleri 3 hücre entrained Anti-PER2 protein ifade aşamalarını üretmek için birbirleriyle phasic sıcaklık döngüsü (12 saat 32 ° C'de; 12 saat 37 ° C'de) kullanarak (n = 6 ± SEM demek). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Resim 2: CK1δ inhibitörleri ile perfüzyon. (A)şeması perfüzyon sistemi. (B) örnek PER2::LUC kayıt bioluminescence anlık görüntü altında perfüzyon hücreleri. Miktar bir örnek alan Sarı renkle vurgulanır. PER2::LUC perfüzyon altında ve statik koşullarda ve 3 µM CK1 inhibitörü PF670462 olmadan fibroblast biyolüminesans (C) miktar (n = 3, ± SEM demek). Bioluminescence için minimum ve maksimum değerleri normalleştirilmiş. (D) analiz dönemi (Two-way ANOVA, Holm-Sidak'ın birden fazla karşılaştırma testi).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Son orta konsantrasyonu (mikron)</td>
			<td>Hisse senedi (mg/mL)</td>
			<td>400 mL NS21 için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sığır albümin</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katalaz</td>
			<td>0,01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutatyon</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İnsülin</td>
			<td>0,6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Süperoksit Dismutaz</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-thyronine)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-karnitin</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanolamin</td>
			<td>16</td>
			<td>Sıvı (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-galaktoz</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodyum selenit</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleik asit</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenik asit</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoik asit</td>
			<td>0,2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>0,02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol asetat</td>
			<td>0,2</td>
			<td>20</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, tüm trans</td>
			<td>0,3</td>
			<td>10</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tokoferol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tokoferol asetat</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: NS21 hazırlık.
Ek Video 1: örnek video bioluminescence iyi plakalar üzerinden. Örnek video anlık görüntüsünü bioluminescence 6 x 96 iyi plakaları bioluminescence kuluçka ölümsüzleştirdi PER2::LUC üzerinden. Sayısal için kuyu Sarı renkle vurgulanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek Video 2: PER2::LUC kayıt bioluminescence örnek video görüntüsünü hücreleri perfüzyon altında. Miktar bir örnek alan Sarı renkle vurgulanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR at JoVE.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetik olarak kodlanmış luciferase gen ekspresyonu popüler bir non-invaziv muhabir var. Gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging otomatik bir boyuna luciferase çok çeşitli koşullar altında kollarındaki hücrelerden Boylamsal kayıt sağlar. İşte nasıl timsah sirkadiyen ritim araştırma bağlamında kullanılabilir göstermektedir.

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

The overall goal of this system is to allow the easy observation of bioluminescent reporters under a wide range of extracellular conditions including under constant media perfusion. This method can be used to observe bioluminescence longitudinally from cultured cells and tissues. The main advantage of this technique is that it allows for recording from cells under varying extracellular media and gas conditions which is not possible in most existing systems.Although here we demonstrate this technique in the context of circadian rhythm experiments, it could readily be applied to other systems that require bioluminescence or fluorescent recording over time scales from days to weeks. To begin the procedure, seed cultured cells on tissue culture dishes or plates. Incubate the cells at 37 degrees Celsius until the monolayers have reached 100%confluence.Immediately prior to the experiment, use a computer-controlled cycling incubator to alternate between 32 and 37 degrees Celsius every 12 hours for a minimum of 72 hours to synchronize cellular rhythms. Robust synchronization of cellular circadian oscillations both within and between cultures is crucial to experimental reproducibility. We achieve this by applying daily temperature cycles before each recording that synchronize cells by mimicking body temperature rhythms.Alternatively, pharmacological synchronization can also be quite efficacious. Next, combine 8.3 grams of high-glucose DMEM powder with 900 milliliters of ultrapure water. Stir the solution for 30 minutes to fully dissolve the powder.Then, add to the solution 50 milliliters of 100 grams per liter glucose solution, 20 milliliters of a pH 7.6, one molar MOPS solution and 10 milliliters of 100 times penicillin streptomycin solution. Stir the mixture for 10 minutes. Then, add 4.7 milliliters of a 7.5%sodium bicarbonate solution and stir the mixture for five more minutes.Use hydrochloric acid or sodium hydroxide to adjust the pH to 7.6 at room temperature. Add ultrapure water to the solution to achieve a final volume of one liter. Filter the solution through a 0.22 micrometer sterile filter into a sterile flask.Store the filtered stock medium at four degrees Celsius. Immediately prior to performing the experiment, supplement the desired quantity of stock medium with 10%serum, two millimolar GlutaMAX, 2%NS21 and one millimolar of luciferin. Pass the resulting working medium through a 0.22 micrometer sterile filter.Use a five molar solution of sodium chloride to adjust the working medium osmolality to 350 milliosmoles. Then, warm the medium to 37 degrees Celsius in a water bath. Next, to begin focusing the bioluminescence incubator camera, unscrew the water-impermeable heated neutral density filter.In the instrument software, set the exposure time to 0.2 seconds and the kinetic cycle time to 0.3 seconds. Verify that the electron multiplying gain is turned off, then close the setup window and start video recording. Use the focusing cylinder to rotate the camera lens until test items on the appropriate sample shelf are clearly in focus.Then, stop the video recording. Replace the neutral density filter and remove the test items. Next, use the control panel on the front of the bioluminescence incubator to set the desired oxygen, carbon dioxide and temperature levels for the experiment.For a humidified experiment, fill the water tray at the base of the incubator. Remove the cells from the tissue culture incubator and replace the culture medium with the pre-warmed working medium. For humidified experiments using small volumes, seal the plates with gas-permeable film or tape.Place the plates in the bioluminescent incubator. Close the incubator and fasten the door cover to exclude light from the system. Then, in the instrument software, set the acquisition mode to kinetic.Set the desired exposure time. Set accumulations to one, kinetic series length to the desired number of acquisition cycles and kinetic cycle time to the desired imaging interval. Set a shift speed of 4.33 microseconds, a gain of one and an EM gain of the desired level.Then, set the auto-save file type to sif or tiff. Name the auto-save file and set its file path. Set the spooling file type to sif or tiff.Name the file stack and set its file path. Close the setup window and start recording data. Once data collection has finished, import the acquired image stack into image processing software.Adjust the brightness and contrast for optimal viewing of bioluminescence. Then, select regions of interest and export the mean signal for the selected areas. Copy the data into analysis software for further processing.To begin the experiment, seed cells on single-channel slides with Luer connectors and a channel depth of 0.6 or 0.8 millimeters. Culture and entrain the cells. Prepare and warm hydrogen carbonate buffered low-glucose DMEM perfusion medium.Next, cut five two-centimeter sections of silicon tubing with an inner diameter of one millimeter. Cut 1.2-meter, 10-centimeter and 30 centimeter of one-millimeter inner diameter ethylene tetrafluoroethylene tubing. Sterilize the tubing with 70%ethanol and flush the tubing with sterile PBS.Use the sterilized silicon tubing to connect the 1.2-meter ETFE tubing to a sterile female Luer connector and a sterile elbow Luer connector. Use this assembly to connect the perfusion medium syringe to an empty Luer channel slide. Next, replace the cell culture medium with pre-warmed perfusion medium.Fill a 20-milliliter sterile syringe with pre-warmed perfusion medium. Fit the 10-centimeter ETFE tubing with Luer connectors using the silicon tubing and connect the tubing to the slide. Flush three to five milliliters of perfusion medium through the tubing and the channel slide.Then, fit the 30-centimeter ETFE tubing to the cell-containing channel slide. Connect the free end of the 10-centimeter ETFE tubing to the other end of the cell channel slide to form the complete perfusion system. Flush one milliliter of perfusion medium through the tubing and slides to exclude air bubbles.Transport the perfusion system to the bioluminescence incubator. Secure the perfusion medium-filled syringe in a syringe pump being careful not to disconnect the tubing. Use the syringe pump to flush one milliliter of perfusion medium through the perfusion system.Enter the syringe diameter on the pump, and set the flowrate to 50 microliters per hour. It is crucial there are no bubbles in the perfusion system at the start of the experiment as these can disrupt the bioluminescence signal. Start the pump and immediately close the bioluminescence incubator door.Fasten the door cover to exclude light from the system. Acquire and analyze the data as described for static tissue cultures. Six plates of PER2 LUC fibroblasts were entrained using daily temperature cycles and imaged using a bioluminescence incubator.Images from selected wells were analyzed and the bioluminescence output was quantified. PER2 LUC cells were also imaged under perfusion conditions to evaluate the effects of a Casein kinase inhibitor on PER2 LUC expression. The results were compared to cells treated with the same concentration of the inhibitor under static conditions which revealed substantially greater period lengthening under static conditions.The magnitude of the period lengthening under perfusion conditions was found to be close to that observed in vivo. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform both static and perfused bioluminescence experiments using an ALLIGATOR.

Research

JoVE Journal

Biology

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Otomatik Görüntüleme Sistemi kullanarak iPSC'lerin Birleşme Noktasının Ölçülmesi.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...