Name: in vivo epr assessment of ph, po2, redox status, and concentrations of phosphate and glutathione in the tumor microenvironment
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

עבודה זו מומן בחלקו על ידי NIH מעניקה CA194013, CA192064 ו- U54GM104942. WVCTSI הוא הודה על סטארט-אפ ועד VVK, AB, ו- TDE. המחברים תודה ד ר מ' Gencheva ק' שטיינברגר על הסיוע עם הניסויים המחשה. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של NIH.

כל בעלי החיים העבודה בוצעה לפי פרוטוקול IACUC WVU אושרה.
1. בדיקה סינתזה וכיול
<ol><li>חלקיקי pO2-רגיש בדיקה לינק-BuO הערה: לינק-BuO microcrystals הם מסונתז והוא המוכן כפי שמתואר הפניה13. הם יציבים מאוד, יכול להישמר בטמפרטורת החדר במשך שנים. Linewidth EPR של המכשיר ח?...

<ol>
	<li>Siemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tumor Microenvironment. , (2011).</li><li>Tatum, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia:+importance+in+tumor+biology,+noninvasive+measurement+by+imaging,+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy.">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).</li><li>Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signalling+controls+metabolic+demand.">Hypoxia signalling controls metabolic demand.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).</li><li>Haulica, A., Ababei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+glycolytic+activity+in+the+erythrocytes+of+animals+with+chronic+experimental+hypoxia+and+with+tumours.">Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours.</a> Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+tumor+redox+status+by+magnetic+resonance+imaging+using+nitroxides+as+redox-sensitive+contrast+agents.">High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents.</a> Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).</li><li>Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+in+cancer+biology+and+therapy.">Glutathione in cancer biology and therapy.</a> Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).</li><li>Voegtlin, C., Thompson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+content+of+tumor+animals.">Glutathione content of tumor animals.</a> J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+Inorganic+Phosphate+as+a+Tumor+Microenvironment+Marker+for+Tumor+Progression.">Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression.</a> Sci Rep. 7, 41233 (2017).</li><li>Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+imaging.+A+review+of+pH+measurement+methods+and+applications+in+cancers.">pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers.</a> IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).</li><li>Gade, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intratumoral+convection:+pressure-dependent+enhancement+in+chemotherapeutic+delivery+to+solid+tumors.">Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).</li><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+pH,+redox+status,+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors.">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).</li><li>Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphonated+Trityl+Probe+for+Concurrent+In+Vivo+Tissue+Oxygen+and+pH+Monitoring+Using+EPR-based+Techniques.">Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques.</a> JACS. 135, 5904-5910 (2013).</li><li>Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+particulate+spin+probe+for+targeted+determination+of+oxygen+in+cells+and+tissues.">Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues.</a> Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).</li><li>Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+Longitudinal+EPR+Monitoring+of+Tissue+Oxygenation,+Acidosis,+and+Reducing+Capacity+in+Mouse+Xenograft+Tumor+Models.">Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models.</a> Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).</li><li>Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+and+reversible+modification+of+thiols+using+imidazolidine+biradical+disulfide+label.">Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label.</a> J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).</li><li>Roshchupkina, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR+measurement+of+glutathione+in+tumor-bearing+mice+using+improved+disulfide+biradical+probe.">In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe.</a> Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).</li><li>Khramtsov, V. V., Zweier, J. L., Hicks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , 537-566 (2010).</li><li>Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourier+Transform+EPR+of+Trityl+Radicals+for+Multifunctional+Assessment+of+Chemical+Microenvironment).">Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment).</a> Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).</li><li>Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical NMR spectroscopy. , (1980).</li><li>Lin, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+to+malignancy+in+the+polyoma+middle+T+oncoprotein+mouse+breast+cancer+model+provides+a+reliable+model+for+human+diseases.">Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).</li><li>Eubank, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+inhibits+breast+cancer+growth+and+metastasis+by+invoking+an+anti-angiogenic+program+in+tumor-educated+macrophages.">Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages.</a> Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).</li><li>Khramtsov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+SH+groups+in+low-+and+high-molecular-weight+compounds+by+an+electron+spin+resonance+method.">Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method.</a> Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).</li><li>Komarov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+paramagnetic+resonance+monitoring+of+ischemia-induced+myocardial+oxygen+depletion+and+acidosis+in+isolated+rat+hearts+using+soluble+paramagnetic+probes.">Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).</li><li>Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+binding+of+the+Finland+trityl+radical+with+bovine+serum+albumin.">Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin.</a> Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).</li><li>Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+Phenomena+in+the+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectra+of+the+Nitroxyl+and+Trityl+Radicals:+Multifunctional+Spectroscopy+and+Imaging+of+Local+Chemical+Microenvironment.">Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment.</a> Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).</li><li>Samouilov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Proton-Electron+Double-Resonance+Imaging+of+Extracellular+Tumor+pH+Using+an+Advanced+Nitroxide+Probe.">In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe.</a> Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).</li><li>Goodwin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tumour+extracellular+pH+monitoring+using+electron+paramagnetic+resonance:+the+effect+of+X-ray+irradiation.">In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation.</a> NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).</li></ol>

השיטות שהוצגו לאפשר לא פולשנית ויוו הערכת פרמטרים קריטיים של טיים כימי, כלומר pO2pH, מצב חמצון-חיזור, ריכוזים של interstitial Pi ו GSH תאיים. טכניקות תהודה מגנטית, כגון MRI ו- EPR נמוך-השדה, הן שיטות הבחירה לא פולשנית ויוו בניית פרופיל של פרמטרים אלה טיים. MRI מדמיין מבנים אנטומיים אבל ח?...

תפקיד מרכזי של טיים התקדמות סרטן, טיפול הוא מוערך יותר ויותר1. בין פרמטרים פיזיולוגיים חשובים של טיים גידולים מוצקים, רקמות היפוקסיה2, חמצת3,4, גבוהה תוך צמצום קיבולת5, ריכוזים גבוהים של6,תאיים GSH7, פאי interstitial8 מתועדים היטב. הערכות2, pH, Pi, GSH, חמצון-חיזור לא פולשנית ויוו pO מספקים תובנות ייחודיות לתוך התהליכים הביולוגיים טיים, לעזור כלים מראש להקרנה קליניים של תרופות נוגדות סרטן, אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות טיים. גלי רדיו סביר חדירה לעומק ברקמות על ידי תהודה מגנטית (MRI), טכניקות מבוססות EPR שדה נמוך גורם להם את הגישות המתאים ביותר עבור הערכה לא פולשנית של פרמטרים אלה טיים. MRI מסתמכת במידה רבה על הדמיה פרוטונים במים, נעשה שימוש נרחב הגדרות קליניים כדי לספק רזולוציה אנטומי אבל חסר פתרון פונקציונלי. המידות תהודה מגנטית גרעינית זרחן-31 (31P-NMR) של חוץ-תאית Pi ריכוז ו- pH בהתבסס על אות מ פוספט אנדוגני פוטנציאלי אטרקטיבי עבור אפיון טיים, אבל הם בדרך כלל על ידי רעולי פנים מספר פעמים גבוה יותר תאיים Pi ריכוזים9,10. לעומת זאת, מדידות EPR לסמוך על ספקטרוסקופיה, הדמיה של מיוחד המיועד הגששים פאראמגנטיים לספק פתרון פונקציונלי. שים לב כי הגששים EPR אקסוגני יש יתרון על פני אקסוגני NMR רגשים בשל הרגישות גבוהה יותר של מהותי של EPR ואת היעדר רקע אנדוגני EPR אותות. ההתפתחות האחרונה של nitroxyl pH, חמצון-חיזור בתפקוד כפול בדיקה11 ו trityl רב תכליתיים בדיקה12 מספקת הזדמנויות ללא תחרות עבור ויוו מדידות במקביל של מספר פרמטרים טיים שלהם המתאם ניתוחים עצמאיים על בדיקה הפצה והזמן המדידה. הידע שלנו, הם לא שיטות אחרות הזמינות להעריך במקביל ויוו פיזיולוגית כימי טיים פרמטרים חשובים בנושאים החיים, כגון pO2, ה-pHאלקטרוני, Pi, חמצון-חיזור, GSH.
רגשים עבור אין ויוו המידות פונקציונלי:
איור 1 מציג את מבנה כימי של הגששים פאראמגנטיים המשמשים לגישה טיים פרמטרים, אשר כוללים חלקיקים ולא מסיסים הגששים. רגישות גבוהה פונקציונלי, יציבות רקמה חיה, רעילות מינימלית הם כמה מהיתרונות שגורמים חלקיקי הגששים מועדפת על פני מסיסים זונדי ויוו EPR oximetry. לדוגמה, הגששים חלקיקי הגבירו שמירה פעמים באתר של רקמה השתל לעומת הגששים מסיסים המאפשרות מדידת האורך של רקמות pO2 במשך מספר שבועות. מצד שני, הגששים מסיסים להכות חלקיקים הגששים על-ידי מתן מידות המרחבי לפתור באמצעות מבוסס-EPR הדמיה טכניקות כמו גם מאפשר ניתוח בו-זמני של פונקציות מרובות (pO2, pH, Pi, חמצון-חיזור, ו GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> איור 1. מבנה כימי של הגששים פאראמגנטיים זה להרכיב טיים הערכת assay. זה כולל את המקדח חלקיקי pO2 , לינק-BuO (R =3CH - O (CH2)3), וזונדים מסיסים: פונקציה כפולה בדיקה pH, חמצון-חיזור, נ; GSH-רגיש הגישוש, RSSR; רב תכליתיים pO2, pH ו- Pi המכשיר microenvironment חוץ-תאית, החללית תקווה. הסינתזה של רגשים אלו תואר 11,הפניות שסופקו12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="703">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-band EPR spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">Magnettech, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Temperature &#38; Gas Controller&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Noxygen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Temperature &#38; Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GSH (L-Glutathione reduced)</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MMTV-PyMT&#160; mice</td>
			<td style="width:201px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Met-1 murine breast cancer cells</td>
			<td style="width:201px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57Bl/6 wild type mice&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Exclusion Dye&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ohmeda Fluotec 3&#160;</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane (IsoFlo)</td>
			<td style="width:201px;">Abbott Laboratories</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:201px;">sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S07051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:201px;">sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:201px;">sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:201px;">sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:201px;">sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose oxydase</td>
			<td style="width:201px;">sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lauda Circulator E100</td>
			<td style="width:201px;">Lauda-Brikmann</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pH meter Orion</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiNc-BuO probe</td>
			<td style="width:201px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NR probe</td>
			<td style="width:201px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RSSR probe</td>
			<td style="width:201px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOPE probe</td>
			<td style="width:201px;">In house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo epr assessment of ph, po2, redox status, and concentrations of phosphate and glutathione in the tumor microenvironment

פרוטוקול זה מדגים את היכולת של אלקטרון נמוך-שדה פאראמגנטיים תהודה (EPR)-המבוסס על טכניקות בשילוב עם הבדיקות פאראמגנטיים תפקודית כדי לספק מידע כמותי על microenvironment הגידול כימי (טיים), לרבות p O2, pH, מצב חמצון-חיזור, ריכוזים של פוספט אורגניים interstitial (Pi), ו גלוטתיון תאיים (GSH). בפרט, יישום של בדיקה שפותחו לאחרונה trityl רב תכליתיים מסיסים מספק הזדמנות מתחרות על ויוו מדידות בו-זמניות של pH, pO2 ו- P. אני ב- E xtracellular החלל (תקווה העצמית). המידות של שלושה פרמטרים באמצעות בדיקה אחת מאפשרים את בדיקותיהם המתאם עצמאית של בדיקה הפצה, זמן של המדידות.

רקמה p O 2 רגשים הערכה באמצעות לינק-BuO:
באמצעות ההליך המתואר תחת שלב 1.1, ביצענו הכיול של הבולם microcrystals לינק-BuO המוכנים באופן טרי. איור 2 מציג את התלות חמצן טיפוסי של linewidth...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

נמוך-שדה (L-band, 1.2 GHz) אלקטרון פאראמגנטיים תהודה באמצעות הגששים nitroxyl ו- trityl מסיס הוא הפגין עבור הערכה של פרמטרים חשובים מבחינה פיזיולוגית ב microenvironment הגידול במודלים של העכבר של סרטן השד.

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

The overall goal of this in vivo electron paramagnetic resonance technology is to quantitatively and noninvasively assess the physiologically relevant parameters of local tissue microenvironment in preclinical settings in animal models of cancer. This technique is based on the combination of flourofield APR with special design functional paramagnetic probes to provide quantitative information on tissue oxygenation as CDT in dock status as well as interstitial organic phosphate and intercellular concentrations. This noninvasive technique provides unique insight into the world of tumor microenvironment and tumor regenesis and may contribute to the future rational design of tumor microenvironment targeted anticancer therapeutics.The application of this technique extend toward brain's corelation between the parameters of application of multifunctional APR probes. Therefore providing additional insight into underlying biological mechanisms. In addition to me and Andrey, demonstrating the procedure will be Marieta Gencheva and Dr.Benoit Driesschaert and a graduate student, Kayla Steinberger from IMMR Center.To prepare the particulate oxygen sensitive probe, first weigh 60 milligrams of the microcrystals. For oxygen sensitivity calibration, suspend microcrystals in three milliliters of dolbeckas modified eagle media. Sonicate for five minutes, on ice, with a probe sonicator at 20 kilohertz using seven watts of power in a five milliliter glass round bottom tube.Next, place one milliliter of the sonicated microcrystals in a glass tube in the surface coil resignator of the L-band EPR spectrometer. Acquire continuous waves EPR spectra at the physiological temperature of 37 degrees Celsius and oxygen concentrations of zero, one, two, four, eight, and 20.9 percent. To prepare the dual function pH and redox probe, dissolve 6.34 milligrams of the probe in one milliliter of saline solution.Adjust the pH to 7.2 with small allocates of hydrochloric acid or sodium hydroxide using a pH meter. To perform the pH calibration of the nitroxide probe, first add 0.1 milliliter of the probe stock solution to 0.9 milliliters of two millimolar sodium phosphate buffer, 150 millimolar sodium chloride. Then titrate the obtained one millimolar probe solution with allocates of hydrochloric acid or sodium hydroxide to the required pH using a pH meter.Record the EPR spectra of the samples in 1.5 milliliter microcentrifuge tubes using the L-band EPR spectrometer. To prepare the GSH sensitive RSSR probe, dissolve 4.05 milligrams of the probe in one milliliter of DMSO solution. Next, determine the value of the rate constant of the reaction of RSSR with GSH.To do so, first add 20 microliters of the RSSR stock solution to 0.98 milliliters of one millimolar phosphate buffer pH 7.2, 150 millimolar sodium chloride to obtain a 0.2 millimolar RSSR probe solution. Then mix equal volumes of 0.2 millimolar RSSR solution in one of the GSH solutions for a final concentration of the probe at 0.1 millimolar and of GSH at 0.5, one, or 2.5 millimolar. Immediately after RSSR and GSH solution mixing, place the sample in the EPR resignator and record the EPR spectra every 12 seconds for 10 minutes.Then calculate the kinetics of the increase of the monoradical spectral amplitude for the multifunctional HOPE probe for oxygen pH and Pi assessment. Dissolve 10.7 milligrams of the probe in one milliliter of saline solution and adjust the pH to 7.4. Then add 20 microliters of the prepared stock solution to 0.98 milliliters of the saline solution to obtain a 0.2 millimolar probe solution.For probe calibration of the pH, titrate 0.2 millimolar of the probe solution by the addition of a small volume of sodium hydroxide or hydrochloric acid so that the final dilution of sample less than 1%Acquire the EPR spectra at intermediate pH as described in the text protocol. For oxygen sensitivity probe calibration, acquire EPR spectra of the probe at various oxygen concentrations as described in the text protocol. For probe calibration of Pi, acquire EPR specra of the probe at various phosphate concentrations.Use the radical solution with a pH value near the PKA and titrate it with various phosphate concentrations. Maintain the temperature and gas composition as before. In the case of the MET1 tumor model for internalization of the particulate probe into MET1 cells, add 100 microliters of the sonicated suspension to a T75 flask with 10 milliliters of culture media containing MET1 cells.All procedures take place in a biosafety cabinet and the media contains penicillin and streptomycin to minimize potential infection. Incubate the cells at 37 degrees Celsius for 72 hours or until they reach approximately 80%confluency. Aspirate the media and wash the cells five times with 10 milliliters of PBS.Detach the cells with five milliliters of tripson EDTA. After collecting the cells and centrifuging as before, stain the sample of cells of the exclusion dye to determine cell viability and quantity. Suspend the cells at a concentration of one million cells per 100 microliters in minimal DMEM.Using an insulin syringe, slowly inject 100 microliters of the cell suspension containing the internalized microcrystals into the number four mammary fat pads of an eight week old, female, wild-type mouse as described in the text protocol. Monitor tumor initiation and growth. For EPR spectroscopic measurements, anesthetize the mice by inhalation of air isophlorane mixture using an anesthesia machine as described in the text protocol.Perform functional measurements using an L-band EPR spectrometer by placing the surface coil resignator onto a normal mammary gland or a mammary tumor. Proceed to tune the spectrometer. In the case of soluble probes, acquire the EPR spectra immediately after probe injection for five to 10 minutes.Acquire the EPR spectra from the implanted particulate probe for five to 10 minutes over several weeks after implantation. Finally, analyze the EPR spectra and the probes as described in the text protocol. The EPR spectral sensitivity of particulate LiNc-BuO probe to oxygen is shown here.The EPR spectrum was measured at 0%of pO2 and 37 degrees Celsius. Representative dependents of the line width of the EPR spectrum of the probe suspension on oxygen partial pressure is shown. The line width increases linearly with pO2.A spectrum measured in mammary tumor tissue of an anesthetized female mouse corresponds to tissue partial oxygen of 7.5 millimeters of mercury. L-band EPR spectra of the NR probe solution were acquired at 37 degrees Celsius at various pH levels. Dependents of the observed hyperfine splitting constant on pH is plotted and fitted with the standard titration curve.Shown here is the multifunctional tumor microenvironment assessment combining the oxygen sensitive LiNc-BuO probe in the dual function pH in redox NR probe. The observed triplet spectrum of the NR is superimposed with the single EPR line of LiNc-BuO probe embedded within tumor. In vivo EPR assessment of intracellular tissue glutathione concentrations is shown here.Kinetics of the monoradical spectral peek intensity change measured by L-band EPR in mammary tumor in normal mammary gland of FVBN mice immediately after intratissual injection of RSSR probe are shown. The faster kinetics reflects the higher GSH concentration in tumor tissue. The technique assists investigators in the field of cancer research with surpassed opportunity for in vivo performing of cellular physiological important parameters of tumor microenvironment and the transpotential for the translation.The sensitives of the probes according to the previous procedures requires expertise in synthetic chemistry and is critical for presentation. Our center reported the difficult of this technology and to the sites on a collaborative basis.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

מיקרו-דיסקציה מתועשת, מונחית בינה מלאכותית בלייזר לניתוח פרוטאומי בקנה מידה זעיר של המיקרו-סביבה של הגידול

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

הערכת אולטרסאונד לא פולשנית של התקדמות סרטן רירית הרחם במחיקה מכוונת Pax8 של מדכאי הגידול Arid1a ו - Pten בעכברים

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to ...