Name: isolation and respiratory measurements of mitochondria from arabidopsis thaliana
Uploaded: 2018-01-05T13:00:00
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Diese Studie wurde unterstützt durch eine australische Forschung Rat Centre of Excellence in Anlage Energie Biologie CE140100008, eine australische Rat Zukunft Forschungsstipendium (FT130100112), MWM und ein Feodor-Lynen-Forschungsstipendium (Alexander von Humboldt Stiftung, Deutschland), JS.

Dieses Protokoll dient zur Isolierung von intakte Mitochondrien von Arabidopsis Thaliana Organe auf Boden mit kontinuierlichen kolloidales Dichtegradienten angebaut. Alle Verfahren, die nach der Sammlung des Materials erfolgt bei 4 ° C.
1. Vorbereitung des Schleifens Medium, Waschpuffer und Gradient Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie 300 mL des Schleifens Medium (minus Ascorbat und Cystein) und 200 mL 2 X Waschpuffer pro Tabelle 1 einen Tag vor der Isolation, bei 4 ° ...

<ol>
	<li>Day, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+in+plant+mitochondrial+research.+Methods+in+molecular+biology.">Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology.</a> Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).</li><li>Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+function-location+nexus:+Using+multiple+lines+of+evidence+in+defining+the+subcellular+location+of+plant+proteins.">Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins.</a> Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).</li><li>Eubel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-flow+electrophoresis+for+purification+of+plant+mitochondria+by+surface+charge.">Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge.</a> Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).</li><li>Murcha, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+into+plant+mitochondria:+Signals,+machinery,+processing,+and+regulation.">Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation.</a> J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).</li><li>Carrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+defining+dual-targeted+proteins+in+Arabidopsis.">Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis.</a> Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).</li><li>Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+perspectives+in+the+redox+code+-+Mass+spectrometric+proteomics+studies+of+moonlighting+proteins.">Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. , (2016).</li><li>Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterisation+of+chlorophyll-free+mitochondria+from+pea+leaves.">Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves.</a> Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Cheah, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+oxygen+kinetic+isotope+effects+using+membrane+inlet+mass+spectrometry+can+differentiate+between+oxidases+for+mechanistic+studies+and+calculation+of+their+contributions+to+oxygen+consumption+in+whole+tissues.">Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues.</a> Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).</li><li>Chrobok, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metabolic+role+of+mitochondria+during+developmental+leaf+senescence.">Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence.</a> Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).</li><li>Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+proteomics+of+root+and+shoot+mitochondria+and+transcript+analysis+to+define+constitutive+and+variable+components+in+plant+mitochondria.">Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria.</a> Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).</li><li>Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteome+heterogeneity+between+tissues+from+the+vegetative+and+reproductive+stages+of+Arabidopsis+thaliana+development.">Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development.</a> J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).</li><li>Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+mitochondrial+respiration+in+plants.">Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).</li><li>Peters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+-+complex+II+ratio+strongly+differs+in+various+organs+of+Arabidopsis+thaliana.">Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).</li><li>Werhahn, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+preprotein+translocase+of+the+outer+mitochondrial+membrane+from+Arabidopsis+thaliana:+Identification+of+multiple+forms+of+TOM20.">Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20.</a> Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).</li><li>Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+analysis+of+the+rice+mitochondrial+proteome.">Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome.</a> Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).</li></ol>

In der Regel verlässt Isolation von Mitochondrien aus Arabidopsis Renditen bis 3 mg der Mitochondrien von ca. 80-100 3 - 4 - Wochen alten Pflanzen, obwohl Renditen von mehr als 5 mg oft mit gründlichen Schleifen erreicht werden können. Der Ertrag variiert je nach Wachstumsbedingungen und sinkt dramatisch, als Senesce, verlässt obwohl Mitochondrien Struktur scheint während der Seneszenz9gut gepflegt werden. Eines der wichtigsten Features, einen guten Ertrag zu erhalten ist die Methode des Schl...

Die Geschichte der mitochondrialen Pflanzenforschung reicht über 100 Jahre1. Intakte Mitochondrien wurden zuerst in den frühen 1950er Jahren isoliert mit differentielle Zentrifugation. Das Aufkommen der kolloidalen Dichtegradient in den 1980er Jahren erlaubt Mitochondrien gereinigt werden, ohne Leiden osmotische Anpassung. Während gradient gereinigte Mitochondrien geeignet für die meisten Zwecke wegen der Empfindlichkeit der Massenspektrometrie sind, auch relativ geringfügige Verunreinigungen können erkannt werden und eine mitochondriale Lage2unangemessen zugewiesen werden können. Die Verwendung von der free Flow-Elektrophorese kann beide plastidic entfernen und Peroxisom Kontamination3, aber frei fließen Elektrophorese ist eine hochspezialisierte Technik und ist für die überwiegende Mehrheit der Studien nicht erforderlich. Darüber hinaus tritt bei Bestimmung der Lage eines Proteins muss es sein, dass zwei oder mehrere targeting von Proteinen erinnert in Zellen. Über 100 dual gezielte Proteine sind beschrieben für Chloroplasten/Plastiden und Mitochondrien4und eine Reihe Proteine gezielt an Mitochondrien und Peroxisomen sind auch5bekannt. Darüber hinaus befindet sich re Proteine unter spezifischen Reize, z. B. oxidativen Stress, eine aufkommende Thema in Zelle Biologie6. So die Position der Proteine im Kontext der studierte Biologie betrachtet werden muss, und eine Vielzahl von Ansätzen dienen zu ermitteln und überprüfen der Position2.
Mitochondrien sind in der Regel von Pflanzengewebe durch Homogenisierung isoliert, ein Gleichgewicht zwischen Aufbrechen der Zellwand um Mitochondrien zu lösen, und nicht zu schädigen die Mitochondrien erforderlich ist. Traditionell werden mit Kartoffeln und Blumenkohl, Homogenisierung Haushalt Mixer/Entsafter Apparat zu einem Flüssigextrakt in einem Puffer mit verschiedenen Komponenten zu erhalten. Isolation von Mitochondrien aus Erbse Blätter (ein beliebtes Material für mitochondriale Isolierung mit Jungpflanzen (~ 10 Tage alt), nutzt ein Blender, um Zellen zu lösen, da das Blattmaterial weich ist. Mit der Verfügbarkeit von Arabidopsis Thaliana T-DNA insertional Knock-out-Linien erforderte die Notwendigkeit, Mitochondrien, funktionelle Untersuchungen durchzuführen zu reinigen können die Entwicklung von Methoden zur Mitochondrien aus Blatt, Wurzel oder Blüte isolieren Gewebe. Insgesamt arbeitete für andere Pflanzen entwickelten Methoden gut7mit Perquisite, die Schleifen des Materials musste optimiert werden. Für Arabidopsis dies in eine Vielzahl von Möglichkeiten (siehe unten) erreicht werden kann, und unterscheidet sich zwischen Gewebetypen (Wurzel im Vergleich zu schießen). Die Verwendung des kontinuierlichen Verlaufs auch optimiert werden als die Dichte von Mitochondrien aus verschiedenen Organen oder Entwicklungsstufen bedeutet, dass sie anders migrieren können. Für maximale Trennung kann so die Dichte des Gradienten verfeinert, um sicherzustellen, um beste Trennung zu erreichen.
Einmal gereinigt, die Mitochondrien können für eine Vielzahl von Studien, einschließlich Protein und tRNA-Aufnahme-Experimente, Enzym-Aktivität-Assays, Atmungskette Messungen und western-Blot Analysen verwendet werden. Isolierte Mitochondrien können auch für Massenspektrometrie Analysen der Protein Fülle verwendet werden. Gezielte mehrere Reaktion monitoring (MRM) Analysen ermöglicht die Quantifizierung der Proteine definiert, aber erfordern erhebliche Assay-Entwicklung. Im Gegensatz dazu bietet Quantifizierung von Dimethyl oder anderen Isotop Etiketten8, einen Entdeckung Ansatz bei der Identifizierung von Differenzen über das ganze Proteom, das verwendet werden kann, um neue biologische Einblicke aufzudecken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOX antibody</td>
			<td>from Tom Elthon</td>
			<td></td>
			<td>Elthon et al., 1989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0157</td>
			<td>Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSAS 1.0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity western ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1705061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5678104</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3131</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar, granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214530</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamborg B-5 Basal Medium</td>
			<td>Austratec</td>
			<td>G398-100L</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamborg Vitamin Solution (1000x)</td>
			<td>Austratec</td>
			<td>G219-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706516-2ml</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706515-2ml</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td>
			<td>Austratec</td>
			<td>M524-100L</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5580</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ndufs4 antibody</td>
			<td>from Etienne Meyer</td>
			<td></td>
			<td>Meyer et al., 2009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propyl gallate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3130</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Chemical, colloidal density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone (PVP40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034-100G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>SA030</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 &#183; 10H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1704271</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Chemical, detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blocking Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11921681001</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-26XP</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3117-9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulator</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>1124971</td>
			<td>Attached to oxygen electrode chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flask</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropper</td>
			<td></td>
			<td>3 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>JA25.5</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Funnel</td>
			<td>Per Alimenti</td>
			<td>14 cm</td>
			<td>For filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient pourer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-4120</td>
			<td>For preparation of gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer ATE</td>
			<td>VELP Scientifica</td>
			<td>F20300165</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM475855-1R</td>
			<td>Filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td>Jamie Oliver</td>
			<td>Granite, 6 Inch</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2view</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Oxygen monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus System</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>1187253</td>
			<td>Clark-type oxygen electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Artist first choice</td>
			<td>1008R-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155001</td>
			<td>For preparation of gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC peristaltic tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F117930</td>
			<td>For preparation of gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VELP Scientifica</td>
			<td>OCB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and respiratory measurements of mitochondria from arabidopsis thaliana

Mitochondrien sind wesentliche Organellen beteiligt zahlreiche Stoffwechselwege in Pflanzen, vor allem die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) aus der Oxidation von reduzierten Verbindungen wie Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NADH) und Flavin Adenin Dinucleotide (FADH2). Die vollständige Kommentierung der Arabidopsis Thaliana Genom wurde es festgestellt, als die am weitesten Modell der Anlage verbreitete, und somit die Notwendigkeit, Mitochondrien aus einer Vielzahl von Organen (Blatt, Wurzel oder Blüte) zu reinigen notwendig ist, die Werkzeuge in vollem Umfang nutzen, sind jetzt verfügbar für Arabidopsis, mitochondriale Biologie zu studieren. Mitochondrien sind durch Homogenisierung des Gewebes mit einer Vielzahl von Ansätzen, gefolgt von einer Reihe differentielle Zentrifugation Schritte produzieren einen groben mitochondriale Pellet, der weiter gereinigt wird mit kontinuierlicher kolloidales Dichtegradienten isoliert Zentrifugation. Das kolloidale Dichte Material wird anschließend durch mehrere Zentrifugation Schritte entfernt. Ausgehend von 100 g frisches Blattgewebe, 2-3 mg der Mitochondrien routinemäßig erhalten. Atemwege Experimente auf diese Mitochondrien zeigen typische Preise von 100-250 Nmol O2 min-1 mg Gesamtprotein mitochondriale-1 (NADH-abhängige Rate) mit der Fähigkeit, verschiedene Substrate und Inhibitoren zu verwenden, um festzustellen, welche Substrate werden oxidiert wird und die Kapazität der Alternative und Cytochrom terminal Oxidasen. Dieses Protokoll beschreibt eine Isolierung der Mitochondrien von Arabidopsis Thaliana Blätter mit kontinuierlichen kolloidales Dichtegradienten und eine effiziente Atemwege Messungen der gereinigten Anlage Mitochondrien.

Dieses Protokoll konnten wir verschiedene mitochondriale Proteine durch SDS-PAGE und Immunoblotting erkennen. Wie in Abbildung 3Adargestellt, ist das Protein isoliert vom Wasser Kultur Gewebe ausreichen, um ein schwaches Band (2 µg) zu erkennen. Signalintensität steigt proportional zu den Beträgen geladen. Für Mitochondrien isoliert von Gewebe gewachsen auf Tellern (Abb. 3 b), die Reaktion auf hohe Lichtstress kann Behandlung...

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Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Da Mitochondrien nur ein kleiner Prozentsatz der Pflanzenzelle sind, benötigen sie für eine Reihe von Studien gereinigt werden. Mitochondrien können aus einer Vielzahl von Pflanzenorganen durch Homogenisierung, gefolgt von Differential und Dichte Gradienten Zentrifugation zu einem hochgereinigten mitochondriale Bruchteil isoliert werden.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

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Biochemistry

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Unit 1

Mitochondria and Energy Production

SCIENTISTS IN ACTION

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Forschung

Biochemie

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Schnelle Isolierung von Mitoribosome von HEK Zellen

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolierung der F1-ATPase aus der parasitären protiste Trypanosomen Trypanosomen

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...