Name: isolation and respiratory measurements of mitochondria from arabidopsis thaliana
Uploaded: 2018-01-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da un australiano ricerca Consiglio centro di eccellenza in pianta energia biologia CE140100008, un australiano Consiglio futuro assegno di ricerca (FT130100112) di MWM e un assegno di ricerca di Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondazione, Germania) a JS.

Questo protocollo viene utilizzato per l'isolamento dei mitocondri intatti da organi di Arabidopsis thaliana coltivati su terreno con pendenze di densità colloidale continuo. La raccolta del materiale di seguito tutte le procedure sono effettuate a 4 ° C.
1. preparazione di macinatura media, lavare, soluzioni tampone e gradienti
<ol><li>Preparare 300 mL di macinazione medio (meno ascorbato e cisteina) e 200 mL di tampone di lavaggio x 2 per ogni tabella 1 un giorn...

<ol>
	<li>Day, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlights+in+plant+mitochondrial+research.+Methods+in+molecular+biology.">Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology.</a> Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).</li><li>Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+function-location+nexus:+Using+multiple+lines+of+evidence+in+defining+the+subcellular+location+of+plant+proteins.">Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins.</a> Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).</li><li>Eubel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-flow+electrophoresis+for+purification+of+plant+mitochondria+by+surface+charge.">Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge.</a> Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).</li><li>Murcha, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+into+plant+mitochondria:+Signals,+machinery,+processing,+and+regulation.">Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation.</a> J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).</li><li>Carrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+defining+dual-targeted+proteins+in+Arabidopsis.">Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis.</a> Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).</li><li>Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+perspectives+in+the+redox+code+-+Mass+spectrometric+proteomics+studies+of+moonlighting+proteins.">Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. , (2016).</li><li>Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterisation+of+chlorophyll-free+mitochondria+from+pea+leaves.">Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves.</a> Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>Cheah, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+oxygen+kinetic+isotope+effects+using+membrane+inlet+mass+spectrometry+can+differentiate+between+oxidases+for+mechanistic+studies+and+calculation+of+their+contributions+to+oxygen+consumption+in+whole+tissues.">Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues.</a> Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).</li><li>Chrobok, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metabolic+role+of+mitochondria+during+developmental+leaf+senescence.">Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence.</a> Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).</li><li>Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+proteomics+of+root+and+shoot+mitochondria+and+transcript+analysis+to+define+constitutive+and+variable+components+in+plant+mitochondria.">Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria.</a> Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).</li><li>Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteome+heterogeneity+between+tissues+from+the+vegetative+and+reproductive+stages+of+Arabidopsis+thaliana+development.">Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development.</a> J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).</li><li>Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+mitochondrial+respiration+in+plants.">Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).</li><li>Peters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+-+complex+II+ratio+strongly+differs+in+various+organs+of+Arabidopsis+thaliana.">Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).</li><li>Werhahn, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+preprotein+translocase+of+the+outer+mitochondrial+membrane+from+Arabidopsis+thaliana:+Identification+of+multiple+forms+of+TOM20.">Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20.</a> Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).</li><li>Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+analysis+of+the+rice+mitochondrial+proteome.">Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome.</a> Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).</li></ol>

In genere, isolamento dei mitocondri da Arabidopsis lascia rendimenti a 3 mg di mitocondri da circa 80-100 3 - 4 - settimana-vecchi impianti, anche se rese superiori a 5 mg possono essere realizzate spesso con accurata macinazione. Il rendimento varia con le condizioni di crescita e diminuisce drammaticamente come foglie ratti senesce, anche se i mitocondri struttura sembra essere ben mantenuto durante la senescenza9. Una delle caratteristiche più importanti per ottenere una buona resa è il meto...

La storia della ricerca mitocondriale pianta ripercorre 100 anni1. I mitocondri intatti in primo luogo sono stati isolati all'inizio del 1950 mediante centrifugazione differenziale. L'avvento di un gradiente di densità colloidale nel 1980 ha permesso i mitocondri per essere purificata senza subire regolazione osmotica. Mentre gradienti mitocondri purificati sono adatti per la maggior parte degli scopi, a causa della sensibilità della spettrometria di massa, contaminanti anche relativamente minore possono essere rilevati e possono essere assegnati in modo inappropriato un mitocondriale posizione2. L'uso del libero flusso elettroforesi può rimuovere entrambi plastidic e peroxisome contaminazione3, ma il libero fluire l'elettroforesi è una tecnica altamente specializzata e non è richiesto per la stragrande maggioranza degli studi. Inoltre, si verifica quando determinazione della posizione di una proteina che deve essere ricordato che dual o targeting più delle proteine nelle cellule. Oltre 100 proteine mirate dual sono descritti per cloroplasti/plastidi e mitocondri4e un numero di proteine mirati ai mitocondri e peroxisomes sono noti anche5. Inoltre, la ri-localizzazione delle proteine sotto stimoli specifici, ad es. stress ossidativo, è un tema emergente nella cellula biologia6. Così, la posizione di proteine deve essere considerato nel contesto della biologia ha studiato, e una varietà di approcci sono utilizzati per determinare e verificare la posizione2.
I mitocondri sono in genere isolati dai tessuti vegetali di omogeneizzazione, è necessario un equilibrio tra rottura aprire la parete cellulare per rilasciare i mitocondri e non danneggiare i mitocondri. Tradizionalmente, con patate e cavolfiori, omogeneizzazione comporta l'uso di apparecchi domestici frullatore/spremiagrumi per rendere un estratto liquido in un buffer con vari componenti per mantenere attività. Isolamento dei mitocondri dalle foglie di pisello, (un materiale popolare per isolamento mitocondriale utilizzando giovani semenzali (~ 10 giorni), utilizza un frullatore per lisare le cellule come il materiale di foglia è morbido. Con la disponibilità di linee di knock-out inserzionali Arabidopsis thaliana T-DNA, la necessità di essere in grado di purificare i mitocondri per svolgere studi funzionali ha reso necessario lo sviluppo di metodi per isolare i mitocondri da foglia, radice o fiore tessuto. Nel complesso i metodi sviluppati per altre piante funzionato ben7, con il perquisite macinazione del materiale necessario per essere ottimizzato. Per Arabidopsis questo può essere realizzato in una varietà di modi (Vedi sotto) e differisce tra tipi di tessuto (radice contro sparare). L'uso del gradiente continuo può essere ottimizzata anche che la densità dei mitocondri da diversi organi o stadi di sviluppo significa che essi possono migrare in modo diverso. Così, per la massima separazione la densità della sfumatura può essere raffinata per garantire per ottenere una migliore separazione.
Una volta purificato i mitocondri possono essere utilizzati per una varietà di studi, compresi gli esperimenti di assorbimento proteico e tRNA, analisi di attività dell'enzima, catena respiratoria misurazioni e analisi western blot. Mitocondri isolati possono anche essere utilizzati per analisi di spettrometria di massa dell'abbondanza di proteine. Reazione più monitoraggio analisi (MRM) consente per la quantificazione della definite proteine, ma richiedono sviluppo di significative analisi mirate. Al contrario, quantificazione di dimetil o altro isotopo etichette8, fornisce un approccio di scoperta nell'identificare le differenze attraverso l'intero proteoma che può essere utilizzato per scoprire nuove conoscenze biologiche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOX antibody</td>
			<td>from Tom Elthon</td>
			<td></td>
			<td>Elthon et al., 1989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0157</td>
			<td>Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSAS 1.0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity western ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1705061</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>5678104</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3131</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar, granulated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214530</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamborg B-5 Basal Medium</td>
			<td>Austratec</td>
			<td>G398-100L</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamborg Vitamin Solution (1000x)</td>
			<td>Austratec</td>
			<td>G219-100ML</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706516-2ml</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706515-2ml</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td>
			<td>Austratec</td>
			<td>M524-100L</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5580</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8129</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ndufs4 antibody</td>
			<td>from Etienne Meyer</td>
			<td></td>
			<td>Meyer et al., 2009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propyl gallate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3130</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Chemical, colloidal density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone (PVP40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034-100G</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>SA030</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 &#183; 10H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1704271</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Chemical, detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blocking Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11921681001</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-26XP</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3117-9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulator</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>1124971</td>
			<td>Attached to oxygen electrode chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flask</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropper</td>
			<td></td>
			<td>3 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>JA25.5</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Funnel</td>
			<td>Per Alimenti</td>
			<td>14 cm</td>
			<td>For filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient pourer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-4120</td>
			<td>For preparation of gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer ATE</td>
			<td>VELP Scientifica</td>
			<td>F20300165</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM475855-1R</td>
			<td>Filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td>Jamie Oliver</td>
			<td>Granite, 6 Inch</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2view</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Oxygen monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus System</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>1187253</td>
			<td>Clark-type oxygen electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Artist first choice</td>
			<td>1008R-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155001</td>
			<td>For preparation of gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC peristaltic tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F117930</td>
			<td>For preparation of gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VELP Scientifica</td>
			<td>OCB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and respiratory measurements of mitochondria from arabidopsis thaliana

I mitocondri sono organelli essenziali coinvolto in numerose vie metaboliche in piante, in particolare la produzione di adenosina trifosfato (ATP) dall'ossidazione di composti ridotti come nicotinamide adenindinucleotide (NADH) e la flavin adenina dinucleotide (FADH2). L'annotazione completa del genoma di Arabidopsis thaliana ha stabilito come il più diffuso sistema pianta modello, e così la necessità di purificare i mitocondri da una varietà di organi (foglia, radice o fiore) è necessaria per utilizzare pienamente gli strumenti che sono ora disponibili per Arabidopsis studiare biologia mitocondriale. I mitocondri sono isolati di omogeneizzazione del tessuto utilizzando una varietà di approcci, seguita da una serie di passaggi di centrifugazione differenziale producendo un pellet mitocondriale grezza che viene ulteriormente purificato mediante gradiente di densità colloidale continuo centrifugazione. Il materiale di densità colloidale viene successivamente rimosso da più passaggi di centrifugazione. A partire da 100 g di tessuto fogliare fresco, 2-3 mg di mitocondri possono essere ottenuti ordinariamente. Respiratori esperimenti su questi mitocondri visualizzare i tassi tipici di 100-250 nmol O2 min-1 mg proteina mitocondriale totale-1 (tasso di NADH-dipendente) con la possibilità di utilizzare vari substrati e inibitori per determinare quali substrati sono sono ossidati e la capacità delle alternative e citocromo ossidasi terminale. Questo protocollo descrive un metodo di isolamento dei mitocondri da foglie di Arabidopsis thaliana usare gradienti di densità colloidale continuo e un'efficiente misure respiratoria dei mitocondri pianta purificata.

Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare diverse proteine mitocondriali di SDS-PAGE e immunoblotting. Come mostrato in Figura 3A, la proteina isolata dal tessuto di coltura di acqua è sufficiente per rilevare una debole banda (2 µ g). L'intensità del segnale aumenta in proporzione agli importi caricati. Per i mitocondri isolati dai tessuti coltivati sulle piastre (Figura 3B), la risposta allo stress di luce a...

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Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

Come i mitocondri sono solo una piccola percentuale della cellula vegetale, hanno bisogno di essere purificato per una serie di studi. I mitocondri possono essere isolati da una varietà di organi vegetali di omogeneizzazione, seguita da centrifugazione in gradiente di differenziale e densità per ottenere una frazione altamente purificata mitocondriale.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

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