Name: rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)
Uploaded: 2018-03-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs at JoVE.com

עבודה זו נתמך על ידי המושל ניו ג'רזי המועצה למחקר רפואי, טיפול של אוטיזם (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), ננסי לוריא מסמן קרן נאמנות עופרת Mindworks, קרן הקהילה היהודית של מטרווסט רבתי.

1. נהלי בטיחות ותחזוקה אבטחה הקבינט
<ol><li>
נהלי בטיחות אבטחה ברמה-2 (BSL-2)
	<ol>
<li>פעל לפי ההנחיות של המוסד על עבודה עם חומרים BSL-2. תשליך BSL-2 חומרים על-פי נוהלי המוסד. מציינים חדרים וציוד המשמשים עבור חומרים BSL-2. ללבוש כל ציוד מגן אישי (PPE), כולל חלוק וכפפות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אבטחה לארון תחזו...

הפרוטוקולים המובאת כאן להדגים שיטות מהיר ופשוט ללמוד התפתחותיות היסוד תהליכים ולבדוק גורמי צמיחה ותרופות באמצעות תאים hiPSC-derived קודמן עצבית. hiPSC טכנולוגיה יש מהפכה בחקר בפתוגנזה של מחלות התפתחותיות במתן גישה חסרת תקדים לחיות תאים עצביים האנושי של אנשים מושפעים. אכן, היו מחקרים רבים hiPSC של ה...

השימוש של אורגניזמים פשוטים ומודלים העכבר יש מבואר על מנגנוני התפתחות המוח בסיסיים, כמו גם בפתוגנזה של המחלה. למרות ההתפתחויות הללו, האטיולוגיה של רבים מנוטלי הפרעות נשאר קשה להבנה, כי לא כל הממצאים אורגניזמים פשוטים הרלוונטיים ישירות היבטים מורכבים של מחלות אנושיות. יתר על כן, למורכבות רבה יותר של המוח האנושי לעיתים קרובות מקשה על מודל ההתפתחות האנושית, הפרעות בבעלי חיים. עם התפתחות, התקדמות הטכנולוגיה האנושית pluripotent המושרה בתאי גזע (hiPSCs), תאים סומטיים יכול להיות מחדש לתוך תאי גזע, ואז הבדיל לתוך תאים עצביים ללמוד מחלות אנושיות. ההתקדמות בטכנולוגיות hiPSCs ו "omic" (גנומיקה, transcriptomics, פרוטאומיקס, גליקומיקס) מבטיח לחולל מהפכה להבנת התפתחות המוח האנושי. טכנולוגיות אלה כעת לבצע אפשרי בגישה "דיוק רפואה" אפיון המחלה מנוטלי על בסיס מקרה לגופו.
להדק הנוכחי בתחום הדוגמנות-מחלת hiPSC הוא להתמיין לתאים ספציפי יחוברו עצביים ב טפט או לשימוש מערכת תרבות 3D בשם של תא צורב רוצה להתרכז בהיבטים של המוח פיתוח1,2, 3. מערכות אלו היה בעל ערך רב בלימודים, לחשוף את ההיבטים הייחודיים של ההתפתחות האנושית, מחלת4,5,6,7. עם זאת, תרבויות עצביים והן organoids לעיתים קרובות דורשים בכל מקום שבועות עד חודשים בתרבות לפני שהם מוכנים ללמוד. הטבע זמן רב של פרוטוקולים אלה וכמות המשאבים הדרושים כדי לשמור על שמערכות התרבות אלה מגבילים לעתים קרובות מספר ניסויים שניתן לבצע ואת מספר משתנים (כמו גורמי גדילה או תרופות), אשר יכול להיבדק. יתר על כן, מחקרים רבים הנוירונים הפוסט-mitotic וחומר organoids התמקדו תהליכים כגון היווצרות תוצר או סינפסה דנדריט, אשר מתרחשים מאוחר יותר פיתוח. בעוד תהליכים אלה היו מעורבים הפתולוגיה של הפרעות התפתחותיות כגון אוטיזם, סכיזופרניה, קודם התפתחותית אירועים שמתרחשים לפני סופי בידול עצביים חשובים גם עבור מחלת פתוגנזה8 ,9,10,11,12,13. אכן, גנומית מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תקופת אמצע-עוברית, אשר מורכב של התפשטות, תוצר תהליך ההעברה, חשוב במיוחד אוטיזם פתוגנזה11,14. לכן, חשוב ללמוד גזע עצביים אוכלוסיות תאים קדמון כדי להבין טוב יותר תהליכים קודמות אלה. תא צורב מערכות, אשר מסכם את הדברים נחשב טוב יותר התפתחות המוח האנושי בגלל מבנה מאורגן ואופיים תלת-ממד, מכילות בריכת קדמון זה יש כבר מנוצל ללמוד כמה אירועים קודמות אלה. עם זאת, האוכלוסייה קדמון organoids הוא לרוב דליל, יותר כמו תאי גליה רדיאליים מ עצבית גזע או קדמון תאים5,15. לכן, יהיה זה מועיל יש שיטת תפוקה גבוהה ללמוד בשלבים המוקדמים של neurodevelopment באוכלוסיה פעיל proliferative תא.
במעבדה, יצרנו פרוטוקול העושה שימוש hiPSC-derived קודמן עצבית תאים (NPCs), אוכלוסייה מעורבת של גזע עצביים, ובתאים זה מאוד המקדימות, ללמוד תהליכים התפתחותיות כגון התפשטות, נדידת תאים, ו הרחבת תהליך ראשוני (neurite). מבחני אלה פותחו מתוך טכניקות המשמשות במעבדה שלנו במשך עשרות שנים ללימוד בהצלחה neurodevelopment עכבר ועכבר תרבויות קורטיקלית16,17,18,19,20, 21,22,23. חשוב, זה גם הראו כי פנוטיפים ואת אותות התקינה מוגדרת במערכות תרבות עכבר ועכבר הם מאוד חזוי של מנגנונים כי הם פעיל ויוו, המציינת את הערך של טכניקות אלה16, 17,18,19,24. לאחר הבידול הראשונית של hiPSCs כדי NPCs, שיטות אלה מאפשרים לנו ללמוד תהליכים פיתוחיים חיוני תוך מספר ימים. שיטות אלה יש יתרונות רבים: (1) הן דורשות ציוד מתוחכם יותר, קלים ליישום, משכפל ניסיוני הרבות (2) יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של זמן, מתן אישור מהיר הפארמצבטית של תוצאות, ו- (3) ניתן לבחון את תרבות משתנים כגון מטריצות ציפוי, ההשפעות של גורמי גדילה, פעילות של תרופות במהירות וחסכוני. יתר על כן, אנו מנצלים התפקיד ומבוססת של גורמי גדילה חוץ-תאית כמבקרי קריטי של תהליכים התפתחותיים מגוונים. NPCs נחשפו לבחירת אותות התפתחותית ישירות לעורר אירועים כמו התפשטות, תוצר neurite נדידת תאים, ומצאו שלהם לשפר את היכולת לזהות פגמים שאינם לכאורה תנאי הבקרה19 , 25 , 26 , 27 , 28. כמו כן, להקל על הערכת סמים מספק שדרה חזק לאמץ טכניקות רפואה דיוק כדי לבדוק את היעילות של התערבויות טיפוליות שונות. לפיכך, פרוטוקול זה מקלה על תפוקה גבוהה, לשחזור, ומתודולוגיה פשוטה ללמוד מוקדם התפתחות המוח בפתוגנזה של המחלה, את פוטנציאל ההשפעות המיטיבות של גורמי גדילה וסמים על פנוטיפים התפתחותיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:323px;">PSC Neural Induction Medium: 
			Protocol Link: https://goo.gl/euub7a&#160;</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">A1647801</td>
			<td style="width:472px;">This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Advanced DMEM/F12 Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">12634-010</td>
			<td style="width:472px;">Component of 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">21103049</td>
			<td style="width:472px;">Component of both NIM and 100% Expansion Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:323px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td style="width:472px;">hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Y-27632 (2HCl), 1 mg</td>
			<td style="width:185px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">72302</td>
			<td style="width:472px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:323px;">6 well plates</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">COR-3506</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24 well plates</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-05</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">35 mm dishes</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-01</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Natural Mouse Laminin</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;">23017-015</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F1141</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P0899</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td style="width:472px;">Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">A11105-01</td>
			<td style="width:472px;">1X Cell Detachment Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.5% Trypsin (10X)</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">15090-046</td>
			<td style="width:472px;">10X enzymatic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM9261</td>
			<td style="width:472px;">used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">tritiated [3H]-thymidine</td>
			<td style="width:185px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:111px;">NET027E001</td>
			<td style="width:472px;">Radioactive tritium, thymidine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:111px;">03-337-1</td>
			<td style="width:472px;">Vials for liquid scintillation counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EcoLite(+)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:111px;">0188247501&#160;</td>
			<td style="width:472px;">Liquid scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">8043-30-1194</td>
			<td style="width:472px;">Liquid Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:323px;">Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019</td>
			<td style="width:185px;">Molecular Devices &#38; Skatron Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:472px;">Semi-automatic cell harvester</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Click-iT EdU Alexa Fluor&#174; 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">C10337</td>
			<td style="width:472px;">EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15250061</td>
			<td style="width:472px;">Assessing viability of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Grade GF/C filter paper</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare Life Sciences, Whatman</td>
			<td style="width:111px;">1822-849</td>
			<td style="width:472px;">Glass fiber filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Human Basic FGF-2</td>
			<td style="width:185px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-18B</td>
			<td style="width:472px;">growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38)</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>H-8430</td>
			<td>neuropeptide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)

התפתחות המוח האנושי ממשיך דרך סדרה של תהליכים מתוזמר בדיוק, בשלבים מוקדמים מכובד על ידי התפשטות, הגירה, תוצר neurite; ובשלבים מאוחרים יותר מאופיין תוצר האקסון/דנדריט היווצרות סינפסה. בהפרעות התפתחותיות, לעיתים קרובות אחד או יותר של תהליכים אלה הן משובשות, שמוביל חריגות בתוך מבנה המוח ותפקודו. עם כניסתו של האדם pluripotent המושרה תא גזע (hiPSC) טכנולוגיה, חוקרים עכשיו יש אטומטי בשפע של תאים אנושיים, כי יכול להיות מובחן כמעט כל סוג התא, לרבות נוירונים. תאים אלה ניתן ללמוד גם התפתחות המוח נורמלי וגם בפתוגנזה של המחלה. מספר פרוטוקולים באמצעות hiPSCs ליצור מודל המחלה מנוטלי שימוש סופני הבדיל נוירונים או שימוש תרבות 3D מערכות הנקרא organoids. בעוד ששיטות אלה הוכיחו שלא יסולא בפז לומד פתוגנזה מחלות אנושיות, ישנם מספר חסרונות. הבידול של hiPSCs לתוך הנוירונים דור של organoids ממושך ויקר תהליכים שיכולים להשפיע מספר הניסויים ולא משתנים אשר יכולים להיות מוערך בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בנוסף, בעוד הנוירונים הפוסט-mitotic ו organoids מאפשרים בחקר תהליכים הקשורים למחלות, לרבות תוצר דנדריט, synaptogenesis, הם למנוע בחקר תהליכים מוקדמים יותר כמו התפשטות והעברה. הפרעות התפתחותיות, כגון אוטיזם, שפע ראיות גנטיות, פוסט-מורטם מציינת פגמים בתהליכים התפתחותיים מוקדם. קודמן עצבית תאים (NPCs), אוכלוסיה מאוד proliferative תא, ייתכן מודל מתאים בו לשאול שאלות על תהליכים ontogenetic, מחלת חניכה. אנחנו עכשיו להרחיב את מתודולוגיות למד מן הלומדים פיתוח בתרבויות קורטיקלית עכבר ועכבר כדי NPCs אנושי. השימוש NPCs מאפשר לנו לחקור פנוטיפים הקשורים למחלות ולהגדיר כיצד משתנים (למשל, גורמי גדילה, סמים) השפעה התפתחותית תהליכים שונים כולל התפשטות, העברה של בידול רק אחרי כמה ימים. בסופו של דבר, כלים זה יכול לשמש באופן הדירים תפוקה גבוהה לזיהוי מנגנוני מחלות ספציפיות והן פנוטיפים בהפרעות התפתחותיות.

מטרה אחת של מחקרים אלה הוא להגדיר את הפעילות המקדימות של NPCs, כלומר, עלייה מספרי הטלפון הנייד. זו מושגת על-ידי הערכת לסינתזת DNA של האוכלוסייה בתא סכום, בגישה תפוקה גבוהה זה מודד את ההתאגדות של תימידין tritiated מעקב רדיואקטיבי לתוך התא תמציות, ומשקף את כל התאים עוסקת S-שלב, בין אם ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs at JoVE.com

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

התפתחותיות תהליכים כגון התפשטות ההעברה, תוצר neurite לעיתים קרובות מוטרד מנוטלי מחלות. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקולים להעריך במהירות, reproducibly אלה בתהליכי התפתחותיות NPCs נגזר iPSC אנושי. פרוטוקולים אלה מאפשרות גם להערכת ההשפעות של גורמי גדילה הרלוונטיים הרפוי על פיתוח NPC.

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...