Name: in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de ciencia y tecnología (la mayoría, 105-2320-B-010-007-MY3 para PCC), del Instituto Nacional de investigación de salud (INDH-EX105 10215BC para PCC), del Ministerio de ciencia y tecnología (más 105-2314-B-400-019 a HJK) y del Instituto de investigación nacional de salud (INDH MG-105-SP-10, INDH MG-106-SP-10 HJK). Este trabajo también fue financiado en parte con la Universidad Nacional de Yang Ming en la publicación del manuscrito al PCC. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o reparación del manuscrito.

1. preparación de expresión de Baculovirus construye
<ol><li>
Purificar el SUMO E3 ligasa bZIP K mediante la clonación de cDNA de bZIP K19 en un vector del baculovirus de expresión dual (véase tabla de materiales) con un N-terminal del epítopo-tag. Hemos tenido éxito utilizando una etiqueta octapéptido (indicado en el protocolo como vector-etiqueta-K-bZIP). Nota: La plantilla de ADN para la clonación de la reacción en cadena (PCR) K-bZIP polimerasa es inversa del cD...

<ol>
	<li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity.">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li><li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification,+subnuclear+localization,+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors.">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li><li>Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Src+Homology-2+domain+containing+protein+B+(SHB)+in+beta+cells.">The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).</li><li>Huang, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+pathogenesis+of+SHP2+in+developmental+disorders+and+tumorigenesis.">Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis.</a> Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).</li><li>Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIM-ultaneous+role+for+SUMO+and+ubiquitin.">A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin.</a> Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).</li><li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes:+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins.">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).</li><li>Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+CoREST1+to+SUMO-2/3+contributes+to+gene-specific+repression+by+the+LSD1/CoREST1/HDAC+complex.">Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex.</a> Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).</li><li>Lyst, M. J., Stancheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+SUMO+modification+in+transcriptional+repression+and+activation.">A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).</li><li>Liu, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+by+SUMO-1+stimulates+the+promoters+of+translation+machinery+genes.">Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes.</a> Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).</li><li>Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+functions+in+constitutive+transcription+and+during+activation+of+inducible+genes+in+yeast.">SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast.</a> Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).</li><li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+modification+by+SUMO-2/3+but+not+SUMO-1+prevents+the+epigenetic+activation+of+key+immune-related+genes+during+Kaposi's+sarcoma+associated+herpesvirus+reactivation.">The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation.</a> BMC Genomics. 14, 824 (2013).</li><li>Neyret-Kahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+at+chromatin+governs+coordinated+repression+of+a+transcriptional+program+essential+for+cell+growth+and+proliferation.">Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation.</a> Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).</li><li>Tatham, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+chains+of+SUMO-2+and+SUMO-3+are+conjugated+to+protein+substrates+by+SAE1/SAE2+and+Ubc9.">Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).</li><li>Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+cellular+protein+conjugation+pathways:+The+SUMO+lesson.">Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson.</a> World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Knipscheer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+sumoylation+regulates+SUMO+target+discrimination.">Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination.</a> Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).</li><li>Vethantham, V., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+sumoylation+of+recombinant+proteins+and+subsequent+purification+for+use+in+enzymatic+assays.">In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).</li><li>Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+encodes+a+bZIP+protein+with+homology+to+BZLF1+of+Epstein-Barr+virus.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus.</a> J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).</li><li>Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-bZIP+Mediated+SUMO-2/3+Specific+Modification+on+the+KSHV+Genome+Negatively+Regulates+Lytic+Gene+Expression+and+Viral+Reactivation.">K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation.</a> PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).</li><li>Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsrII--a+novel+restriction+endonuclease+with+a+heptanucleotide+recognition+site.">RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site.</a> Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R-EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Gingold, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transformation.">Bacterial transformation.</a> Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+isolation+of+synaptic+vesicles+from+mammalian+brain.">Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain.</a> Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).</li></ol>

El en vitro la sumoilación protocolo descrito aquí se utiliza rutinariamente para establecer la situación de la sumoilación de sustratos Ubc9 identificados. La limitación principal utilizando el protocolo estándar para el estudio de la función de SUMO E3 ligasa de sumoilación es la abundancia de activación de SUMO E1 y E2 Conjugación enzimas Ubc9 que maximicen la conjugación de SUMO en sistemas in vitro . Teniendo en cuenta este reto, creemos la titulación de la cantidad de enzimas SUMO E1 y...

Modificación de SUMO fue identificado inicialmente como una modificación poste-de translación reversible (PTM) que regula la estabilidad de la proteína1. Además de conjugación directa, SUMO puede también acoplarse a una proteína a través de la interacción no covalente por SUMO interacción motivos (SIMs)2. Similar a la Unión de Tirosil-fosforilación de moléculas que de homología Src 2 (SH2) o phosphotyrosine atar (PTB) dominios3,4, modificación SUMO proporciona una plataforma de interacción adicional para selectivo contratación de SIM que contiene proteínas de efector5,6. Además de regulación de la transducción de la señal, la sumoilación de factores transcripcionales y cromatina remodelación moléculas sirven para modular la gene expresión7,8. Estudios de patrones de sumoilación de genoma han revelado que la modificación SUMO es asociada a positivo9,10 o negativo10,11,12 transcripción Reglamento, en parte debido a la especificidad del paralogue de sumoilación.
Hay tres isoformas principales de SUMO para la proteína conjugando presente en células de mamíferos; Estos incluyen SUMO-1 y la altamente homólogo SUMO-2 y SUMO-3 (denominado SUMO-2/3)13. SUMO se conjuga generalmente a los residuos de lisina (K) en el motivo de consenso ψKxD/E en la proteína diana. La SIM en SUMO E3 ligasas es responsable de la especificidad de paralogue14. En contraste con vías de ubiquitinación que contiene cientos de ligasas E3, sólo ha habido unos SUMO E3 ligasas identificados15. Ligasas de SUMO E3 se definen por propiedades, incluyendo su capacidad para (i) atar Ubc9, (ii) parte de SUMO se unen a través de un dominio SIM y (iii) mejorar la transferencia SUMO de Ubc9 sobre substrato. Ligasa E3 no es absolutamente necesario para SUMO verbal16, pero proporciona sustrato y SUMO paralogue especificidad. Puesto que generalmente sólo una pequeña fracción de la proteína total del sustrato es modificado de SUMO, detección de proteínas sumoiladas en vivo es siempre un reto. Por lo tanto, se necesitan análisis precisos y reproducibles para aclarar la función precisa de modificación de SUMO.
El en vitro la sumoilación ensayo, que evalúa la capacidad de Ubc9 purificada para catalizar la sumoilación de proteínas sustrato, es un ensayo bien-aceptado para el estudio de modificación SUMO17. Sin embargo, SUMO E3 ligasa actividad en la mayoría de los casos no puede ser detectada o solamente se pueden detectar con ligasa SUMO transformada con alta SUMO E3 ligasa actividad y especificidad de sustrato bajo el protocolo estándar debido a la presencia de una abundante cantidad de Ubc918 . El éxito de este ensayo depende en gran medida la valoración cuidadosa de Ubc9 purificada. El ensayo de la sumoilación en vitro descrito aquí se modifica una sumoilación estándar protocolo (véase Tabla de materiales). La observación de mayor modificación SUMO global durante la reactivación del herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi (KSHV) nos llevó a identificar la ligasa E3 SUMO viral que puede ser responsable de la para arriba-regulación de la sumoilación. Tras una proyección en pequeña escala de las proteínas obran recíprocamente de viral SUMO E3 ligasa K bZIP, p53 fue identificado como un sustrato nuevo. En este protocolo, se muestra detalladamente en células de los insectos los pasos involucrados en la expresión y purificación de tipo K-bZIP, una ligasa E3 SUMO viral con especificidad de SUMO-2/3. Se evalúa la capacidad de la K-bZIP purificado para mejorar la sumoilación de p53, un conocido sustrato SUMO, en presencia de cantidades reducidas de enzimas E1 y E2. Usando este análisis modificado de sumoilación, los investigadores pueden confiablemente definir las capacidades del SUMO E3 ligasa SUMOylate novela o sustratos conocidos, que es un paso primordial en el estudio de la sumoilación de la proteína. Además, este método ayuda a identificar nuevos ligasas SUMO E3 con actividad ligasa baja pero la especificidad de sustrato alta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:853px;" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">pFastBac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td style="width:219px;">dual expression baculovirus vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR2.1-TOPO vector</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR product vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">competent cell&#160; E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:153px;">Yeastern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">FYE678-80VL</td>
			<td>competent E. coli cells A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">E. coli DH10Bac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td>competent E. coli cells B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04709705001</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985062</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:153px;">NEW England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CpoI (RsrII)</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Bluo-gal</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1690</td>
			<td>galactosidase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">IPTG</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Grace&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11605094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9393-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">K0254-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">tetracyclin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">LB Broth</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">HEPES</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NaCl</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9888-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">KCl</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5136-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.13760.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TRIS (Base)</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Non-fat milk</td>
			<td style="width:153px;">Fonterra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">glycerol</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">2136-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0694-1L</td>
			<td>detergent A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tween 20</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0777-500ML</td>
			<td>detergent B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Poloxamer 188 solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5556-100ML</td>
			<td>detergent C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">3x Flag peptide</td>
			<td style="width:153px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-FLAG m2 Magnetic beads</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8823</td>
			<td>antibody-tagged magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-1 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40120</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40220</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAGEN Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">12123</td>
			<td>plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Polypropylene tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:153px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CNG3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Loading tip</td>
			<td style="width:153px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">28480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">PVDF</td>
			<td style="width:153px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEF1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Blotting filter paper</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1658001 EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Pierce ECL Western Blotting</td>
			<td style="width:153px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>ECL reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">suspension mixer</td>
			<td style="width:153px;">Digisystem laboratory instruments&#160; Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Kansin instruments Co.</td>
			<td>OS701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ImageQuant LAS 4000 
			biomolecular imager</td>
			<td style="width:153px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Sf9</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B82501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-p53 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-rabbit antibody</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity

Modificación de pequeños ubiquitin-like modifier (SUMO) es una importante modificación poste-de translación (PTM) que media el transduction de la señal sobre todo a través de la modulación de las interacciones proteína-proteína. Similar a la modificación de la ubiquitina, la sumoilación está dirigida por una cascada secuencial de enzimas como enzima activadora de E1 (SAE1/SAE2), enzima E2-Conjugación (Ubc9) y E3 ligasa (es decir, Pia familia, RanBP2 y Pc2). Sin embargo, a diferencia de la ubiquitinación, una ligasa E3 es no esencial para la reacción pero no proporcionan precisión y eficacia para verbal de SUMO. Las proteínas modificadas por sumoilación pueden identificarse por ensayo en vivo mediante inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de sustrato y el immunoblotting con anticuerpos específicos para SUMO. Sin embargo, la demostración de la actividad de la proteína SUMO E3 ligasa requiere reconstitución en vitro de sumoilación ensayos con enzimas purificadas, sustrato y proteínas SUMO. Ya que en las reacciones en vitro , generalmente SAE1/SAE2 y Ubc9, solo son suficientes para Conjugación de SUMO, realce de la sumoilación por una supuesta ligasa E3 no siempre es fácil de detectar. Aquí, describimos una modificada en vitro la sumoilación protocolo que identifica sistemáticamente modificación SUMO usando un sistema en vitro reconstituido. También se presenta un protocolo paso a paso para purificar catalítico activo K-bZIP, una ligasa E3 de SUMO-2/3 viral. Las actividades de la sumoilación de la purificada bZIP de K aparecen en p53, un conocido destino de SUMO. Este protocolo puede no sólo utilizarse para dilucidar las ligasas SUMO E3 novela, sino también para revelar su especificidad paralog SUMO.

Según la información proporcionada por el fabricante, la cantidad de enzima E1 y E2 en el ensayo de sumoilación es de 50 nM y 500 nM, respectivamente. Primero se determinó la cantidad mínima de E2 conjugando enzimas Ubc9 que es capaz de SUMOylate p53 por un análisis de la sumoilación en vitro . Tan bajo como un quinto de la cantidad de Ubc9 utilizado en el estándar en vitro la sumoilación protocolo eficiente SUMOylate p53 (figura 1<...

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In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .

In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

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