Name: application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

המחברים רוצה להודות אריק Fishback (אוניברסיטת דה מוין, דה מוין, איווה, ארה ב) לסיוע שלו עם ירי ועריכת הוידאו. תאי פיברובלסט דמוי PS120 stably לבטא NHE3-wt או NHE3-YRK נמסרו באדיבות מאת ד ר מארק במושבים. שבהם (ג'ונס הופקינס הספר לרפואה של אוניברסיטת, בולטימור, MD, ארצות הברית).

הערה: שני מגברים נדרשים עבור הקלטת הפעילות של מובילי electroneutral על ידי ISE הפניה עצמית בשיתוף עם תיקון מחבר חובק למעקה, מגבר מלחציים תיקון כדי לשמור על התא תצורה של כל תא, (מגבר של impendence גבוהה אלקטרומטר) כדי להקליט הפעילות טרנספורטר באמצעות ISE (ראה טבלה של חומרים). תיקון קלאמפ המגבר מחובר ישירות ל...

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes.">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li><li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na+/H++exchanger-3.">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na/H+exchanger+(NHE1)+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na/2H+stoichiometry.">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium/hydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods.">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li><li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na(+)/P(i)+cotransporter.">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li><li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures.">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li><li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+extracellular,+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes.">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).</li><li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).</li><li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+mammalian+sodium/proton+exchanger+SLC9+gene+family.">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li><li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium/proton+exchangers.">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li><li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers:+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia.">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li><li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9/NHE+gene+family,+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na(+)/H(+)+exchangers.">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li><li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+intestinal+Na+/H++exchange.">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li><li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na+/H++exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction.">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li><li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance.">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li><li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters.">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19 (2001).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region.">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li><li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na+/H++exchanger.">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li><li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell.">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li><li>Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).</li><li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+membrane+patches:+improvements+and+applications.">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li><li>Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).</li></ol>

למרות הפונקציות מכריע של שנאים, השיטות הזמינות ללמוד את פעילותם הן יעילות ואף לא מתאימות. מגבלה אחת היא כי השיטות הזמינות למדוד תנועה יון מתווכת על-ידי טרנספורטר פעילות בלי להתחשב תנודות בהרכב יון תאיים במהלך ניסוי4. השיטה הציג מבטיחה שליטה מדויקת של יון חוץ-תאית, תאיים יצירות...

תחבורה בין יונים מומסים בגבול על פני קרום פלזמה היא חיונית להישרדותו של התאים ומכאן של אורגניזמים1. תחבורה סלקטיבית של יונים, מומסים בגבול מושגת על ידי מערך של חלבונים טרנספורטר וערוץ מיוחדת. מוטציות בחלבונים אלה לעיתים קרובות לגרום מגוון תנאים קליניים, עיבוד טרנספורטר וערוץ חלבונים מטרות אפשריות עבור טיפול תרופתי1. למרבה הצער, הבנת המנגנונים שבבסיס ערוץ וטרנספורטר ורגולציה לעיתים קרובות מוגבל על ידי הגישות לרשות המחקר שלהם פעילות2,3,4.
באופן ספציפי, מסועי בערך תת מתחלקים לשתי קבוצות גדולות בהתאם אם הם לשנות את הפוטנציאל transmembrane תא במהלך ההובלה של מומסים בגבול: מובילי שינוי יון electrogenic [למשל, נתרן-פוספט 2a טרנספורטר משותף (NaPi2a), נתרן סידן מחליף (NCX), וכו '.] או למעליות יון electroneutral ללא שינוי [כגון: מחליף נתרן-פרוטון (NHE), מוביל שיתוף סודיום-כלוריד, NaPi2c, ועוד.]. הפעילות של שני המעמדות של מובילי נחקרו בהרחבה באמצעות קליטת איזוטופים רדיואקטיביים, צבעי פלורסנט ממברנה-permeant2. שתי הגישות להעריך את הפעילות של מובילי על ידי מדידת שינויים בריכוז בצובר יונים ספציפיים cytoplasmic ולאחר שתי השיטות יש מגבלות, כגון רגישות בינונית ו ברזולוציה זמן לקוי השליטה תאיים חצרו. ואכן, הפעילות של מובילי רבים תלויה cytoplasmic ריכוז היונים נשאו (למשל, NHE3, NCX), צפויים שינויים בריכוזים אלה יון יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות המשלח2 , 3 , 5. מדידה מדויקת של מנגנונים אלה בחקיקה מוגבל בשיטות קלאסיות.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, שיטות מלחציים תיקון משמשים כדי לחקור את פעילות המשלח2,6. באופן ספציפי, הפניה עצמית אלקטרודות יון סלקטיבית (ISEs)7,8 בשילוב עם התיקון מחבר חובק למעקה המערכת אפשרה לאחרונה את המדידה של electroneutral טרנספורטר פעילות3,4 , 5. ISEs הם מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. איסה זזים למעלה כדי ורחוק קרום התא בחוזרות אופנה מתנדנדות רשומות שינוי מתח (µV). מתח ההבדלים יכולים להיות מומרים יון השטף ערכים באמצעות שיטה כיול כי חל החוק הראשון של Fick של דיפוזיה2,9. בעוד ISEs משמשים לזיהוי השטף של יונים זז מתוך תאים, שיטת מלחציים תיקון שני תאים שלמים או תצורות הפוכה משמשת לבקרה ההרכב יון פוטנציאליים, תאיים ממברנה. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם3,של שומנים, חלבונים-5.
לסיכום, צדדיות של השיטה מלחציים תיקון לעומת כי של שיטות אחרות כדי ללמוד פעילות המשלח עשה תיקון מחבר חובק למעקה מתאימים על מנת להתגבר על המגבלות נפוצות של השיטות האחרות. השילוב של הכוללות הפניה עצמית ISEs וטכניקות מלחציים תיקון מציעה את האפשרות ייחודי כדי למדוד את הפעילות של מובילי electroneutral בסביבה ניסיוני פיקוח הדוק, לגלות את הרומן biophysical ומולקולרית המאפיינים של קרום התא תחבורה3,4,5. גישה זו שימש בהצלחה ללמוד את הפעילות של NHE. משפחת יונקים חלבונים NHE מזרז ההחלפה נטו electroneutral חוץ-תאית נתרן (Na+) עבור פרוטון תאיים (H.+)10,11 ניצול של הדרגה Na+ פנימה. ביונקים, משפחת חלבונים NHE כולל חלבונים הקשורים 11 (NHE1-9 ו- NHA1-2) של הזרע ספציפי NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a משפחה) נמצאים ubiquitously רוב היצורים החיים של אאוקריוטים פשוטה כדי פרוקריוטים גבוה ומעורבים במגוון של התא חיוני פונקציות10,11, כולל שליטה את ההגנה מליחות תא אאוקריוטים, שמירה על הומאוסטזיס חומצה בסיס וכרך תא, מווסת את ספיגת מלח ומים שונים מיוחדים epithelia10,12,14,15. התפקיד הביולוגי מפתח של NHEs ואת המשמעות של הפונקציות שלהם שנקבע באמצעות מספר מחקרים; עם זאת, מחקרים מעטים חקרו את המאפיינים biophysical ומולקולרית של יונקים NHEs בגלל מגבלות מתודולוגי4. לאחרונה, היישום של הכוללות הפניה עצמית של ISEs במהלך תיקון שלם-תא מחבר חובק למעקה חשפה את הרומן המנגנונים המולקולריים של NHE איזופורמים מוסדר על ידי שינויים ריכוזי יונים, חלבונים, פוספוליפידים3, תאיים 4.
באופן ספציפי, פרוטוקול בתנאי כתב יד זה מתאר את הדרכים ואת הגישות ללמוד את פעילות וויסות של NHE isoform 3 (NHE3), שחקן מרכזי לספיגת נוזלים HCO3– , Cl–, Na+ מברשת קרום הגבול של כליות, מעיים epithelia14,16. תובנה חדשה הבדלים הרגישות של פעילות NHE3 כדי phosphoinositides תאיים (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4.5) P2], phosphatidylinositide 3,4,5-טריפוספט [PI(3,4,5]P3]) הוא דיווח. תא תחבורה חלבונים, כגון ערוצי מובילים, מוסדרים על ידי phosphoinositides17, NHE3 נקשר ישירות P2 PI (4.5) והן P3 PI (3,4,5)18. על סמך הספרות הנוכחי, גם phosphoinositide יכול להיות רלוונטי להסדרת פיזיולוגיים או pathophysiological NHE35,18,19. הממצאים שלנו תומך בתפקידים נפרד PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) בוויסות פעילות NHE3. הבחנה זו התאפשרה בשל היישום של טכניקות ISE בשילוב עם הקלטה מלחציים תיקון כל תא. טכניקה זו מאפשרת גם שליטה על התוכן הסלולר phosphoinositide ויה זלוף תאיים של phosphoinositides שונים במהלך המדידה של פעילות NHE3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Patch clamp Amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:276px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-1650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Differential Amplifier (DP-301)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Patch Clamp Software Based on MatLab</td>
			<td style="width:219px;">MatLab with acquisition toolbox</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>The capmeter software is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">ThermoClamp-1 Temperature Control System</td>
			<td>&#160;AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:101px;">03-11-LL</td>
			<td>In-line heater</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:101px;">1B120F-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Used for ion selective electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14755-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Carbon tetrachloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">319961-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Hydrogen ionophore I - cocktail B</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">95293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Thin Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:219px;">&#160;Sutter Instrument</td>
			<td style="width:101px;">B200-156-15</td>
			<td style="width:276px;">Used for patch clamp pipette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td>
			<td style="width:219px;">Molex (Polymicro Technologies)</td>
			<td>106815-0018</td>
			<td style="width:276px;">Used for intra-pipette perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Potassium aspartate&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">EGTA</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">PIPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MOPS</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Tris</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Apyrase</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-4508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-3908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

הובלת יונים דרך קרום התא מבטיחה שליטה בסדר של יון תוכן בתוך ומחוץ לתא שעליו היא הכרחית להישרדות התא. מנגנונים אלה התחבורה הם מתווכת על-ידי הפעילות של חלבונים מוביל מתמחה. באופן ספציפי, pH dynamics דק נשלטים על ידי מערכות ההבלטה קרום פלזמה פרוטונים (H.+), כגון Na+/H+ מחליף (NHE) חלבון המשפחה. למרות המאמצים ללמוד המנגנונים NHE תקנה, ההבנה הנוכחית שלנו של המאפיינים biophysical ומולקולרית של משפחת NHE זה לא מספיק בשל המוגבל של שיטות למדוד ביעילות NHE פעילות . כתב יד זה, השתמשנו H+-אלקטרודות סלקטיבית במהלך כל-תא תיקון הקלטה clamping כדי למדוד את השטף הנוצרות על-ידי NHE H+ . אנחנו הציע גישה זו כדי להתגבר על כמה מגבלות של בדרך כלל השתמשו בשיטות למדידת פעילות NHE, כגון ספיגת רדיואקטיבי permeants ממברנה פלורסנט. מדידה של פעילות NHE באמצעות השיטה המתוארת מאפשר רגישות גבוהה, זמן רזולוציה ובקרה יעיל יותר של ריכוזים H+ תאיים. H+-אלקטרודות סלקטיבית הן מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. H+-סלקטיבית אלקטרודה מעבר, הרחק קרום התא בצורה שחוזרת על עצמה, מתנדנדות רשומות שינוי מתח התלויים השטף H+ . בעוד H+-אלקטרודות סלקטיבי משמשים לזיהוי שטף H+ עוזבת התא, השיטה מלחציים תיקון בתצורה שלם-תא משמשת לבקרה ההרכב יון תאיים. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם שומנים. הפעילות מוביל של NHE isoform 3 (NHE3) נמדדה באמצעות גישה טכנית זו ללמוד את הבסיס המולקולרי של תקנה NHE3 על ידי phosphoinositides.

ISE הפניה עצמית במהלך ההקלטה מלחציים תיקון שלם-תא הוחל ללמוד ויסות פעילות NHE3 על ידי phosphoinositides. PS120 תאי פיברובלסט כמו24, שחסרה את הביטוי של קרום פלזמה אנדוגני NHEs, שימשו. NHE3 פראי-סוג (NHE3-wt) או מוטציות NHE3 זה אין איגוד phosphoinositides [טירוזין 501, ארגינין 503, ליזין 505 היו שהוחלפ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

The method of giant patches combined with ion-selective microelectrodes is a versatile method used to detect and quantify ion fluxes. Specifically, it is used to measure the proton fluxes generated by the activity of the electro-neutral ion transporter, the sodium-hydrogen exchanger or NHE, which is expressed on the cell membrane. The sodium-hydrogen exchanger generates a gradient of protons in close proximity to the plasma membrane, indicated here as an orange ring.This gradient of protons across the cell membrane is measured by whole cell patch clamp recording combined with a technique that uses a proton selective microelectrode. The proton selective microelectrode is moved close to the cell surface, where it records the flux of protons moving out from the cells, shown here in position A.And away from the cell surface, where it records the free proton concentration present in the solution indicated by position B.And then, back to position A, close to the cell membrane, in a repetitive, oscillatory movement. The voltage difference from A to B is recorded and is dependent on the representative of the NHE activity.Transporter ions such as protons across the cell membrane affect process essential to life. Therefore, changes in pH are tightly regulated by an array of molecules, including the sodium-proton exchanger, a plasma membrane proton exclusion system. The oscillating pH microelectrode combined with whole cell patch clamping is a novel approach to study the proton flux mediated by the sodium-proton exchanger activity.Application of this methods overcome some of the major limitation of typically used techniques to measure sodium-proton exchanger activity, such as moderate sensitivity, and time resolution and another good control of the intracellular environment. I will give a demonstration of the methods together with my collaborator, Dr Victor Babich. Dr Matthew Henry will be the narrator.We are going to demonstrate an application of this method by measuring the activity of the sodium-proton exchanger isoform three that is a major regulator of absorption of salt in water across the intestine and renal epithilium. The proton selective microelectrodes for the measurement of the proton concentration are fabricated from standard borosilicated glass tubing. Borosilicate glass electrodes having a 1.2 millimeter external diameter and without filament are pulled with a vertical puller, using a conventional double pull protocol.A pipette tip of two to three micrometers in diameter is obtained. The pipettes are placed in a jar holder with the pipette tip facing up. Next, a mixture is prepared to siliconize the pipettes.It is poured into a jar and the lid is closed tightly. Pipettes are incubated with the siliconization mixture for 24 to 48 hours. Use caution, be sure to prepare the mixture and siliconize the pipettes at room temperature in a well ventilated chemical fumehood.Back fill the pipette with the appropriate ion selective resin and carefully place it vertically in a jar holder with the pipette tip facing down. To prepare for patch clamping, begin by pulling patch clamping pipettes from thin-walled borosilicate glass with an external diameter of two millimeters and internal diameter of 1.4 millimeters in a vertical puller using conventional double pull protocol. Use a microforge mounted on a stage of an inverted microscope to make a wide pipette tip.Position the pipette close to the thick platinum wire of the microforge. Turn on the heat using a foot switch that controls the current on and off. Heat the low melting point glass that covers the middle of the thick platinum wire of the microforge and then move the pipette tip close to the melted soft glass.The heating moves the platinum wire slightly towards the center. The platinum wire returns to the initial position and the pipette tip breaks. Repeat the procedure until the desired tip diameter is obtained and finally, apply heat to smooth the tip.Pipette tips are 10 micrometers in diameter after polishing with the microforge. Using the thick platinum wire is a benefit in that there is little expansion after turning on the electricity and less possibility of overheating the wire and pipette with excessive current. After the cells are dissociated using trypsin and trypsinization is blocked, cells are maintained on a shaker with rocking to prevent formation of clumps.This is done for up to two hours following trypsinization. The electrophysiology set up consists of a temperature controller to regulate the temperature of the solution in the perfusion system. All experiments are performed at about 37 degrees Celsius.And an optical filter switcher to control the filter wheel for fluorescence imaging. A perfusion system valve controller to regulate the opening and closing of the perfusion system valves. And the temperature controller to regulate the temperature of the recording chamber.An oscilloscope to observe waveforms and a patch clamp amplifier. A computer running this Capmeter software. And an electrometer to record ion selective microelectrode signal.And a differential amplifier to amplify the signal of the electrometer. The electrophysiology setup is equipped also with an inverted microscope with stage controller, two micro-manipulators with controllers positioned on the left and right sites of the microscope, the perfusion system with inline solution heater. After the ion selective microelectrode pipette is mounted to the micromanipulator, back fill the patch clamping pipette with the intracellular solution.Make sure that the solution reaches the tip of the pipette. It might require several gentle taps to eliminate bubbles in the tip of the pipette. Then mount the patch clamping pipette to the head stage of the electrophysiology setup.Gently transfer healthy appearing cells to the recording chamber filled with a defined volume of bath solution. It is important to keep the head stage at a 45 degree angle to the horizontal axis. This ensures an entry angle for the pipette that is suitable for the formation of a highly resistant seal.While the patch clamp pipette is lowered in the bath solution, apply a small amount of positive pressure to the pipette to reduce the chance of blocking the tip. Select a cell and approach it with a small amount of positive pressure. Stop moving the patch clamp pipette once the tip is close to the cell.Lower the ion selective microelectrode in the bath solution until it is the same focal plane of the patch clamp pipette tip. When the pipette is centrally positioned over the cell, initiate the seal by applying a small amount of negative pressure. A mega-ohm seal is obtained within a few seconds.Make sure that the holding potential is maintained by the amplifier at zero millivolts. Finally, rupture the cell membrane with a series of short pulses of suction and start the recording. Using the giant patch recording method, it is possible to perfuse solutions rapidly in the glass pipette via an intrapipette perfusion system to modify the intracellular content of ions, lipids, and proteins.Position the ion selective microelectrode pipette close to the cell held by the patch clamp pipette and start the oscillation of the ion selective microelectrode pipette by moving it to and from the cell. Application of this technique allows one to study the molecular regulation of the sodium-hydrogen exchanger. Taking advantage of the giant patches method, the intracellular composition of ATP and lipids was modified by an intrapipette perfusion system.Intracellular perfusion of apyrase, which hydrolyzes intracellular ATP and decreases phosphoinositide content caused a 50%decrease in NHE isoform three activity. The apyrase effect on NHE3 activity was not reversed by intracellular perfusion of the phosphoinositide, PIP2. However, it was reversed by the intracellular perfusion of the phophoinositide, PIP3.Measurement of NHE activity takes advantage of combining the proton selective microelectrode and patch clamping methods. This allows for the study of the molecular basis behind the differential regulation of NHE by phosphoinositides and downstream signal cascades. After watching this video, you should have a good comprehension on how to measure the activity of the sodium-proton exchanger using an oscillating pH microelectrode combined with all cell patch clamping.And an example of possible application of the methods.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Applying Microfluidics to Electrophysiology

יישום מיקרופלואידיקה Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Spinal Cord Electrophysiology

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...