Name: application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer Eric Fishback (Universidade de Des Moines, Des Moines, Iowa, EUA) pela ajuda com gravação e edição de vídeo. As células de fibroblastos, como PS120 estàvel expressando NHE3-wt ou NHE3-YRK foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, EUA).

Nota: Dois amplificadores são necessárias para gravar a atividade dos transportadores de electroneutral por uma auto-referência ISE em conjunto com o patch de aperto, um amplificador de braçadeira do remendo para manter a célula em uma configuração de células inteiras e um (amplificador de alta impedância eletrômetro) para registrar a atividade de transporte através do ISE (ver tabela de materiais). O amplificador de braçadeira do remendo está directamente ligado ao terminal da placa de aquisição. O eletr?...

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes.">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li><li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na+/H++exchanger-3.">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na/H+exchanger+(NHE1)+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na/2H+stoichiometry.">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium/hydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods.">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li><li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na(+)/P(i)+cotransporter.">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li><li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures.">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li><li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+extracellular,+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes.">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).</li><li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).</li><li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+mammalian+sodium/proton+exchanger+SLC9+gene+family.">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li><li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium/proton+exchangers.">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li><li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers:+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia.">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li><li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9/NHE+gene+family,+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na(+)/H(+)+exchangers.">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li><li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+intestinal+Na+/H++exchange.">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li><li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na+/H++exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction.">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li><li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance.">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li><li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters.">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19 (2001).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region.">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li><li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na+/H++exchanger.">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li><li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell.">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li><li>Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).</li><li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+membrane+patches:+improvements+and+applications.">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li><li>Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).</li></ol>

Apesar das funções cruciais de transportadores, os métodos disponíveis para estudar sua atividade são inadequado e ineficaz. Uma limitação é que os métodos disponíveis medem o movimento de iões mediado pela atividade de transporte, sem considerar as flutuações na composição iônica intracelular durante o experimento4. O método apresentado garante um controle preciso de composições de íon extracelular e intracelular e oferece uma poderosa ferramenta para modificar intracelular de...

Transporte de íons e solutos através da membrana de plasma é essencial para a sobrevivência das células e, portanto, de organismos1. Transporte seletivo de íons e solutos é alcançado por uma matriz de canal especializado e proteínas de transporte. Mutações nestas proteínas geralmente resultam em uma variedade de condições clínicas, canal e transportador proteínas alvos em potencial para o tratamento farmacológico1de renderização. Infelizmente, compreender os mecanismos subjacentes a função canal e transportador e regulamento é muitas vezes limitada pelas abordagens disponíveis para estudar sua atividade2,3,4.
Especificamente, os transportadores podem ser mais ou menos sub divididos em dois grandes grupos, dependendo se eles alterar o potencial transmembrana da célula durante o transporte de solutos: os transportadores de íons electrogenic alterando [por exemplo, fosfato de sódio- co-transportador 2a (NaPi2a), trocador de sódio-cálcio (NCX), etc.] ou os transportadores não alteram de íon electroneutral [por exemplo, o trocador de sódio-próton (NHE), co transportador de cloreto de sódio, NaPi2c, etc.]. As atividades de ambas as classes de transportadores têm sido estudadas extensivamente usando captação de isótopos radioativos e membrana-permeant fluorescente tinja2. Ambas as abordagens estimam a atividade dos transportadores medindo mudanças na concentração de íons citoplasmáticos específicos em massa, e os dois métodos têm limitações, como moderada sensibilidade e resolução de tempo e controle inadequado do intracelular Milieu. Com efeito, a atividade de muitos transportadores é dependente da concentração citoplasmática dos íons realizadas (por exemplo, NHE3, NCX), e alterações nas concentrações desses íons são esperadas para desempenhar um papel significativo na regulação da atividade de transporte2 , 3 , 5. medição precisa destes mecanismos regulador é limitada usando métodos clássicos.
Para superar essas limitações, métodos de braçadeira do remendo são utilizados para estudar a atividade de transportador2,6. Especificamente, a auto-referência eletrodos íon-seletivos (ISEs)7,8 combinada com o sistema de fixação de patch foi recentemente autorizado a medição da actividade de transporte de electroneutral3,4 , 5. ISEs são baseada no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. Um ISE movendo-se para e longe da membrana celular em um repetitivo, moda oscilatória registra uma diferença de tensão (MV). Diferenças de voltagem podem ser convertidas em valores de fluxo de iões utilizando um método de calibração que se aplica a primeira lei de Fick da difusão2,9. Enquanto ISEs são usados detectar o fluxo de íons em movimento de células, o método de braçadeira do remendo em ambas as células inteiras ou configurações de dentro para fora é usado para controlar a composição iônica intracelular e potenciais de membrana. Além disso, a aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lipídios e proteínas de3,5.
Em resumo, a versatilidade do método braçadeira remendo comparado com que outros métodos para estudar atividade de transporte fez remendo aperto apropriado para superar as limitações comuns destes outros métodos. A combinação de auto-referência ISEs e técnicas de braçadeira do remendo oferece a possibilidade única para medir a atividade dos transportadores de electroneutral em um ambiente experimental rigidamente controlado e descobrir romance biofísico e molecular Propriedades da membrana celular de transporte3,4,5. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para estudar a atividade do NHE. A família de proteínas mamífera NHE catalisa o intercâmbio líquido de electroneutral de sódio extracelular (Na+) para intracelular próton (H+)10,11 , utilizando um gradiente at+ para dentro. Nos mamíferos, a família de proteínas NHE inclui 11 proteínas relacionadas (NHE1-9 e NHA1-2) e um esperma específico NHE10,12,13.
Laiane (família SLC9a) é encontrados ubiquitously na maioria dos organismos vivos de simples procariontes para eucariontes superiores e está envolvidos em uma variedade de células vitais funções10,11, inclusive controlando a defesa de salinidade de célula em procariontes, mantendo o volume de homeostase e célula de ácido-base e regula a absorção de água e sal em vários epitélios especializados10,12,14,15. As funções biológicas chaves de laiane e a importância das suas funções foram determinados através de vários estudos; no entanto, alguns estudos têm investigado as propriedades biofísicas e moleculares de mamíferos laiane devido a limitações metodológicas4. Recentemente, a aplicação de auto-referência ISEs durante o aperto de células inteiras remendo revelou novos mecanismos moleculares de isoformas NHE regulamentadas por alterações nas concentrações intracelulares de íons, proteínas e fosfolipídios3, 4.
Especificamente, o protocolo fornecido neste manuscrito descreve os métodos e abordagens para estudar a atividade e o Regulamento de NHE isoform 3 (NHE3), um jogador importante na absorção de Na+, Cl–, HCO3– e fluido na membrana de fronteira escova do epitélio intestinal e renal14,16. Nova visão nas diferenças de sensibilidade do NHE3 atividade de remodelamento intracelular (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfato [PI (4,5) P2] e phosphatidylinositide 3, 4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) é relatado. Proteínas de transporte celular, tais como canais e transportadores, são regulamentadas pelo remodelamento17e NHE3 vincula diretamente tanto PI (4,5) P2 e P3 PI (3, 4,5)18. Com base na literatura atual, qualquer phosphoinositide pode ser relevante para a regulação fisiológica ou fisiopatológico da NHE35,18,19. Nossos resultados suportam funções separadas para PI (4,5) P2 e P3 de PI (3, 4,5) na regulação da atividade NHE3. Esta distinção foi possível graças à aplicação de técnicas ISE em combinação com gravação de braçadeira do remendo de células inteiras. Esta técnica também permite o controle do phosphoinositide conteúdo celular através da perfusão intracelular de remodelamento diferentes durante a medição da actividade NHE3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Patch clamp Amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:276px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-1650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Differential Amplifier (DP-301)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Patch Clamp Software Based on MatLab</td>
			<td style="width:219px;">MatLab with acquisition toolbox</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>The capmeter software is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">ThermoClamp-1 Temperature Control System</td>
			<td>&#160;AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:101px;">03-11-LL</td>
			<td>In-line heater</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:101px;">1B120F-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Used for ion selective electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14755-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Carbon tetrachloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">319961-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Hydrogen ionophore I - cocktail B</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">95293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Thin Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:219px;">&#160;Sutter Instrument</td>
			<td style="width:101px;">B200-156-15</td>
			<td style="width:276px;">Used for patch clamp pipette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td>
			<td style="width:219px;">Molex (Polymicro Technologies)</td>
			<td>106815-0018</td>
			<td style="width:276px;">Used for intra-pipette perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Potassium aspartate&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">EGTA</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">PIPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MOPS</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Tris</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Apyrase</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-4508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-3908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

O transporte de íons através das membranas celulares garante o controle fino de ião dentro e fora da célula que é indispensável para a sobrevivência da pilha. Estes mecanismos de transporte são mediados pela actividade de proteínas de transporte especializado. Especificamente, dinâmica de pH é finamente controlada por sistemas de extrusão de prótons (H+) de membrana plasmática, tais como o at+/h+ família de proteínas de cambista (NHE). Apesar de extensos esforços para estudar os mecanismos subjacentes Regulamento NHE, nossa compreensão atual das propriedades biofísicas e moleculares da família NHE é inadequada, devido à limitada disponibilidade de métodos para medir efetivamente a atividade NHE . Neste manuscrito, usamos H+-eletrodos seletivos durante a célula inteira remendo gravação aperto para medir o fluxo induzido por NHE H+ . Propusemos que esta abordagem para superar algumas limitações do normalmente usado métodos para medir atividade NHE, como absorção radioativa e fluorescente membrana permeants. Medição de atividade NHE, usando o método descrito permite alta sensibilidade e resolução de tempo e controle mais eficiente das concentrações intracelulares de H+ . H+-eletrodos seletivos são baseado no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. H+-elétrodo seletivo do movimento até e fora da membrana celular, de forma repetitiva, oscilatória registra uma diferença de tensão que é dependente do fluxo de H+ . Enquanto H+-eletrodos seletivos são usados para detectar o fluxo de H+ , movendo-se fora da célula, o método de braçadeira do remendo na configuração da célula inteira é utilizado para controlar a composição iônica intracelular. Além disso, aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lípidos. A atividade de transportador de NHE isoform 3 (NHE3) foi medida usando esta abordagem técnica para estudar a base molecular do Regulamento NHE3 pelo remodelamento.

Uma auto-referência ISE durante a gravação de braçadeira do remendo de célula inteira foi aplicado para estudar a regulamentação da atividade de NHE3 pelo remodelamento. PS120 células de fibroblastos,24, que falta a expressão da membrana plasmática endógena laiane, foram usados. NHE3 selvagem-tipo (NHE3-wt) ou NHE3 mutantes que não vincular remodelamento [tirosina 501, 503 de arginina e lisina 505 foram substituídos com alanina, Y501A/R503A/K505A (NHE3...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

The method of giant patches combined with ion-selective microelectrodes is a versatile method used to detect and quantify ion fluxes. Specifically, it is used to measure the proton fluxes generated by the activity of the electro-neutral ion transporter, the sodium-hydrogen exchanger or NHE, which is expressed on the cell membrane. The sodium-hydrogen exchanger generates a gradient of protons in close proximity to the plasma membrane, indicated here as an orange ring.This gradient of protons across the cell membrane is measured by whole cell patch clamp recording combined with a technique that uses a proton selective microelectrode. The proton selective microelectrode is moved close to the cell surface, where it records the flux of protons moving out from the cells, shown here in position A.And away from the cell surface, where it records the free proton concentration present in the solution indicated by position B.And then, back to position A, close to the cell membrane, in a repetitive, oscillatory movement. The voltage difference from A to B is recorded and is dependent on the representative of the NHE activity.Transporter ions such as protons across the cell membrane affect process essential to life. Therefore, changes in pH are tightly regulated by an array of molecules, including the sodium-proton exchanger, a plasma membrane proton exclusion system. The oscillating pH microelectrode combined with whole cell patch clamping is a novel approach to study the proton flux mediated by the sodium-proton exchanger activity.Application of this methods overcome some of the major limitation of typically used techniques to measure sodium-proton exchanger activity, such as moderate sensitivity, and time resolution and another good control of the intracellular environment. I will give a demonstration of the methods together with my collaborator, Dr Victor Babich. Dr Matthew Henry will be the narrator.We are going to demonstrate an application of this method by measuring the activity of the sodium-proton exchanger isoform three that is a major regulator of absorption of salt in water across the intestine and renal epithilium. The proton selective microelectrodes for the measurement of the proton concentration are fabricated from standard borosilicated glass tubing. Borosilicate glass electrodes having a 1.2 millimeter external diameter and without filament are pulled with a vertical puller, using a conventional double pull protocol.A pipette tip of two to three micrometers in diameter is obtained. The pipettes are placed in a jar holder with the pipette tip facing up. Next, a mixture is prepared to siliconize the pipettes.It is poured into a jar and the lid is closed tightly. Pipettes are incubated with the siliconization mixture for 24 to 48 hours. Use caution, be sure to prepare the mixture and siliconize the pipettes at room temperature in a well ventilated chemical fumehood.Back fill the pipette with the appropriate ion selective resin and carefully place it vertically in a jar holder with the pipette tip facing down. To prepare for patch clamping, begin by pulling patch clamping pipettes from thin-walled borosilicate glass with an external diameter of two millimeters and internal diameter of 1.4 millimeters in a vertical puller using conventional double pull protocol. Use a microforge mounted on a stage of an inverted microscope to make a wide pipette tip.Position the pipette close to the thick platinum wire of the microforge. Turn on the heat using a foot switch that controls the current on and off. Heat the low melting point glass that covers the middle of the thick platinum wire of the microforge and then move the pipette tip close to the melted soft glass.The heating moves the platinum wire slightly towards the center. The platinum wire returns to the initial position and the pipette tip breaks. Repeat the procedure until the desired tip diameter is obtained and finally, apply heat to smooth the tip.Pipette tips are 10 micrometers in diameter after polishing with the microforge. Using the thick platinum wire is a benefit in that there is little expansion after turning on the electricity and less possibility of overheating the wire and pipette with excessive current. After the cells are dissociated using trypsin and trypsinization is blocked, cells are maintained on a shaker with rocking to prevent formation of clumps.This is done for up to two hours following trypsinization. The electrophysiology set up consists of a temperature controller to regulate the temperature of the solution in the perfusion system. All experiments are performed at about 37 degrees Celsius.And an optical filter switcher to control the filter wheel for fluorescence imaging. A perfusion system valve controller to regulate the opening and closing of the perfusion system valves. And the temperature controller to regulate the temperature of the recording chamber.An oscilloscope to observe waveforms and a patch clamp amplifier. A computer running this Capmeter software. And an electrometer to record ion selective microelectrode signal.And a differential amplifier to amplify the signal of the electrometer. The electrophysiology setup is equipped also with an inverted microscope with stage controller, two micro-manipulators with controllers positioned on the left and right sites of the microscope, the perfusion system with inline solution heater. After the ion selective microelectrode pipette is mounted to the micromanipulator, back fill the patch clamping pipette with the intracellular solution.Make sure that the solution reaches the tip of the pipette. It might require several gentle taps to eliminate bubbles in the tip of the pipette. Then mount the patch clamping pipette to the head stage of the electrophysiology setup.Gently transfer healthy appearing cells to the recording chamber filled with a defined volume of bath solution. It is important to keep the head stage at a 45 degree angle to the horizontal axis. This ensures an entry angle for the pipette that is suitable for the formation of a highly resistant seal.While the patch clamp pipette is lowered in the bath solution, apply a small amount of positive pressure to the pipette to reduce the chance of blocking the tip. Select a cell and approach it with a small amount of positive pressure. Stop moving the patch clamp pipette once the tip is close to the cell.Lower the ion selective microelectrode in the bath solution until it is the same focal plane of the patch clamp pipette tip. When the pipette is centrally positioned over the cell, initiate the seal by applying a small amount of negative pressure. A mega-ohm seal is obtained within a few seconds.Make sure that the holding potential is maintained by the amplifier at zero millivolts. Finally, rupture the cell membrane with a series of short pulses of suction and start the recording. Using the giant patch recording method, it is possible to perfuse solutions rapidly in the glass pipette via an intrapipette perfusion system to modify the intracellular content of ions, lipids, and proteins.Position the ion selective microelectrode pipette close to the cell held by the patch clamp pipette and start the oscillation of the ion selective microelectrode pipette by moving it to and from the cell. Application of this technique allows one to study the molecular regulation of the sodium-hydrogen exchanger. Taking advantage of the giant patches method, the intracellular composition of ATP and lipids was modified by an intrapipette perfusion system.Intracellular perfusion of apyrase, which hydrolyzes intracellular ATP and decreases phosphoinositide content caused a 50%decrease in NHE isoform three activity. The apyrase effect on NHE3 activity was not reversed by intracellular perfusion of the phosphoinositide, PIP2. However, it was reversed by the intracellular perfusion of the phophoinositide, PIP3.Measurement of NHE activity takes advantage of combining the proton selective microelectrode and patch clamping methods. This allows for the study of the molecular basis behind the differential regulation of NHE by phosphoinositides and downstream signal cascades. After watching this video, you should have a good comprehension on how to measure the activity of the sodium-proton exchanger using an oscillating pH microelectrode combined with all cell patch clamping.And an example of possible application of the methods.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Gerados por computador Modelo Estímulos animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Aplicando a microfluídica Eletrofisiologia

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automático de análise de pulsação óptica de pequenos corações

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Introdução à membrana apoiada sólida baseada Eletrofisiologia

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Reconstrução de 3-Dimensional Volume Histologia e sua Aplicação para o Estudo de Rato glândulas mamárias

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

De alta capacidade Análise de Imagem de esferóides tumorais: uma aplicação de software de fácil utilização para medir o tamanho de esferóides automaticamente e com precisão

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...