Name: application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Författarna vill tacka Eric Fishback (Des Moines universitet, Des Moines, Iowa, USA) för hans hjälp med fotografering och redigering videon. PS120 fibroblast-liknande cellerna stabilt uttrycker NHE3-wt eller NHE3-YRK var vänligen tillhandahållen av Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

Anmärkning: Två förstärkare behövs för att registrera aktiviteten av electroneutral transportörer genom en självrefererande ISE i samband med patch fastspänning, en patch clamp förstärkare att upprätthålla cellen i en konfiguration för hela-cell och en hög impendence förstärkare ( elektrometer) att registrera aktiviteten transportören via av ISE (se tabell för material). Patch clamp förstärkaren är direkt ansluten till förvärvet styrelsen terminal. Elektrometer är ansluten till differential förs...

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes.">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li><li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na+/H++exchanger-3.">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na/H+exchanger+(NHE1)+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na/2H+stoichiometry.">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium/hydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods.">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li><li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na(+)/P(i)+cotransporter.">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li><li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures.">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li><li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+extracellular,+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes.">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).</li><li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).</li><li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+mammalian+sodium/proton+exchanger+SLC9+gene+family.">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li><li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium/proton+exchangers.">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li><li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers:+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia.">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li><li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9/NHE+gene+family,+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na(+)/H(+)+exchangers.">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li><li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+intestinal+Na+/H++exchange.">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li><li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na+/H++exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction.">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li><li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance.">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li><li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters.">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19 (2001).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region.">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li><li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na+/H++exchanger.">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li><li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell.">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li><li>Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).</li><li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+membrane+patches:+improvements+and+applications.">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li><li>Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).</li></ol>

Trots den avgörande funktionen transportörer är metoderna som finns att studera deras verksamhet ineffektiva och otillräckliga. En begränsning är att de tillgängliga metoderna mäter ion rörelse medieras av transportören aktivitet utan att beakta fluktuationer i intracellulär jonen sammansättning under de experiment4. Den presenterade metoden garanterar exakt kontroll av extracellulära och intracellulära ion kompositioner och erbjuder ett kraftfullt verktyg för att ändra intracellul...

Transport av joner och koncentrationsfördelningen över plasmamembranet är avgörande för överlevnaden av celler och därmed organismer1. Selektiv transport av joner och koncentrationsfördelningen uppnås genom en rad specialiserade kanal och transportören proteiner. Mutationer i dessa proteiner resulterar ofta i en mängd olika kliniska tillstånd, rendering kanal och transporter proteiner potentiella mål för farmakologisk behandling1. Tyvärr, förstå mekanismerna bakom kanal och transportör funktion och förordning begränsas ofta av metoderna som är tillgängliga att studera deras aktivitet2,3,4.
Specifikt, transportörer kan grovt delas in i två stora grupper beroende på huruvida de ändra cellen transmembrana potential under transport av lösta ämnen: ändra electrogenic ion transportörerna [t.ex. -natriumfosfat kotransportör 2a (NaPi2a), natrium-kalcium exchanger (NCX), etc.] eller icke-förändra electroneutral ion transportörerna [t.ex. natrium-proton exchanger (NHE), natriumklorid kotransportör, NaPi2c, etc.]. Verksamheten i båda klasserna av transportörer har studerats flitigt använda upptag av radioaktiva isotoper och fluorescerande membran-diffusionskoefficient färgämnen2. Båda metoderna uppskatta aktiviteten av transportörer genom att mäta förändringar i bulk koncentrationen av specifik Cytoplasmatisk joner, och båda metoderna har begränsningar, såsom måttlig känslighet och tidsupplösning och otillräcklig kontroll av den intracellulära miljö. Faktiskt, aktiviteten av många transportörer är beroende av den cytoplasmiska koncentrationen av transporteras joner (t.ex. NHE3, NCX), och förändringar i dessa jonkoncentrationer förväntas spela en betydande roll i regleringen transporter aktivitet2 , 3 , 5. exakt mätning av dessa förordningar mekanismer är begränsad använder klassiska metoder.
För att övervinna dessa begränsningar, metoderna patch clamp att studera den transportör aktivitet2,6. Specifikt, har självrefererande jonselektiva elektroder (PFD)7,8 i kombination med plåstret fastspänningssystem nyligen tillåtits mätning av electroneutral transportör aktivitet3,4 , 5. ISEs är baserad på det faktum att transportören aktiviteten skapar en ion lutning i nära närhet till cellmembranet. En ISE att flytta till och från cellmembranet i ett repetitivt, registrerar oscillerande mode en spänningsskillnad (µV). Spänning skillnader kan omvandlas till ion flux värden använder en kalibreringsmetod som gäller ficks första lag av diffusion2,9. Medan ISEs används att upptäcka flödet av joner flyttar av celler, den patch clamp-metoden i både hela-cell eller inifrån och ut konfigurationer används för att styra membranet potential och intracellulär jonen sammansättningen. Dessutom tillåter tillämpningen av giant patch clamp tekniken modifiering av intracellulära sammansättning inte bara joner men också lipider och proteiner3,5.
Sammanfattningsvis jämfört mångsidigheten hos den patch clamp metoden med att transportören aktivitet av andra metoder för att studera har gjort patch fastspänning lämplig att övervinna de vanliga begränsningarna av dessa andra metoder. Kombinationen av självrefererande ISEs och patch clamp tekniker erbjuder den unika möjligheten att mäta aktiviteten av electroneutral transportörer i en väl kontrollerad experimentell miljö och upptäcka roman biofysiska och molekylär egenskaper hos cellmembranet transport3,4,5. Detta tillvägagångssätt har använts framgångsrikt att studera aktiviteten av NHE. Proteinfamiljen från däggdjur NHE katalyserar electroneutral netto utbyte av extracellulära natrium (Na+) för intracellulära proton (H+)10,11 utnyttja en inåtgående Na+ lutning. Hos däggdjur innehåller familjen NHE protein 11 relaterade proteiner (NHE1-9 och NHA1-2) och en sperma-specifika NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familj) finns ubiquitously i de flesta levande organismer från enkla prokaryoter till högre Eukaryoter och medverkar i en mängd viktiga cell funktioner10,11, inklusive kontroll av cell salthalt försvar i prokaryoter, syra-bas homeostas och cell volymen behålls och reglerar upptaget av salt och vatten i olika specialiserade epitel10,12,14,15. NHEs viktiga biologiska roller och betydelsen av deras funktioner har bestämts genom flera studier; några studier har dock undersökt däggdjur NHEs biofysiska och molekylära egenskaper på grund av metodologiska begränsningar4. Nyligen, tillämpningen av självrefererande ISEs under hela-cell patch fastspänning har avslöjat nya molekylära mekanismer av NHE isoformer regleras av förändringar i den intracellulära koncentrationen av joner, proteiner och fosfolipider3, 4.
Specifikt, det protokoll som anges i detta manuskript beskriver de metoder och tillvägagångssätt för att studera aktivitet och reglering av NHE isoform 3 (NHE3), en stor aktör i absorptionen av Na+, Cl–, HCO3– och vätska i den pensel gränserna membran av njur- och intestinal epitel14,16. Nya insikter i skillnaderna i känslighet för NHE3 verksamhet till intracellulära phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-bisphosphate [PI (4,5) P2] och phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) rapporteras. Cell transportproteiner, såsom kanaler och transportörer, regleras av phosphoinositides17och NHE3 binder direkt både PI (4,5) P2 och P3 PI (3,4,5)18. Baserat på den aktuella litteraturen, kan antingen fosfoinositid vara relevanta för fysiologiska eller patofysiologiska regleringen av NHE35,18,19. Våra fynd stöder separata roller för PI (4,5) P2 och PI (3,4,5) P3 i regleringen av NHE3 aktivitet. Denna åtskillnad var möjligt på grund av tillämpningen av ISE tekniker i kombination med hela-cell patch clamp inspelning. Denna teknik möjliggör även styrning av fosfoinositid cellulära innehållet via intracellulära perfusionen i olika phosphoinositides under mätningen av NHE3 aktivitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Patch clamp Amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:276px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-1650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Differential Amplifier (DP-301)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Patch Clamp Software Based on MatLab</td>
			<td style="width:219px;">MatLab with acquisition toolbox</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>The capmeter software is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">ThermoClamp-1 Temperature Control System</td>
			<td>&#160;AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:101px;">03-11-LL</td>
			<td>In-line heater</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:101px;">1B120F-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Used for ion selective electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14755-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Carbon tetrachloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">319961-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Hydrogen ionophore I - cocktail B</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">95293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Thin Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:219px;">&#160;Sutter Instrument</td>
			<td style="width:101px;">B200-156-15</td>
			<td style="width:276px;">Used for patch clamp pipette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td>
			<td style="width:219px;">Molex (Polymicro Technologies)</td>
			<td>106815-0018</td>
			<td style="width:276px;">Used for intra-pipette perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Potassium aspartate&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">EGTA</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">PIPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MOPS</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Tris</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Apyrase</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-4508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-3908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

Transport av joner genom cellmembranen garanterar fina kontroll av ion innehåll inom och utanför cellen som är oumbärlig för cellöverlevnad. Dessa transportmekanismer medieras av verksamheten i specialiserade transporter proteiner. Specifikt, pH dynamics styrs fint av plasmamembranet proton (H+) extrudering system, såsom Na+/h+ värmeväxlare (NHE) protein familj. Trots omfattande insatser för att studera mekanismerna bakom NHE förordning, är vår nuvarande förståelse av familjen NHE biofysiska och molekylära egenskaper otillräcklig på grund av den begränsade tillgången av metoder för att effektivt mäta NHE aktivitet . I detta manuskript, använde vi H+-elektroder under hela-cell patch fastspänning inspelning för att mäta NHE-inducerad H+ flux. Vi föreslog att denna metod att övervinna vissa begränsningar normalt används metoder för att mäta NHE aktivitet, såsom radioaktivt upptag och fluorescerande membran permeanters. Mätning av NHE verksamheten med den beskrivna metoden möjliggör hög känslighet och tidsupplösning och effektivare kontroll av intracellulära H+ koncentrationer. H+-elektroder är baserad på det faktum att transportören aktiviteten skapar en ion lutning i nära närhet till cellmembranet. En H+-selektiv elektrod flyttar upp till och bort från cellmembranet i ett repetitivt, oscillerande mode registrerar en spänningsskillnad som är beroende av H+ flux. Medan H+-elektroder används för att upptäcka H+ flux flytta ut ur cellen, den patch clamp-metoden i hela-cell konfigurationen används för att styra intracellulär jonen sammansättningen. Dessutom tillåter tillämpningen av giant patch clamp tekniken modifiering av intracellulära sammansättning inte bara joner men också lipider. Transportören aktiviteten av NHE isoform 3 (NHE3) mättes med hjälp av denna tekniska metod för att studera den molekylära basen för NHE3 förordning av phosphoinositides.

En självrefererande ISE under hela-cell patch clamp inspelning tillämpades för att studera regleringen av NHE3 aktivitet av phosphoinositides. PS120 fibroblast-liknande celler24, som saknar uttrycket av endogena plasmamembranet NHEs, användes. NHE3 vildtyp (NHE3-wt) eller NHE3 mutanter som inte binda phosphoinositides [tyrosin 501, arginin 503 och lysin 505 var ersatt med alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] uttrycktes stabilt i PS120 fibroblast-liknande celle...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Detta manuskript beskriver tillämpningar av proton-elektroder och patch fastspänning metoder att mäta aktiviteten av proton transportsystem. Dessa metoder övervinna vissa begränsningar av tekniker som ofta används för att studera proton transport aktivitet, till exempel måttlig känslighet, tidsupplösning och otillräcklig intracellulära milieu kontroll.

Tillämpningen av elektrofysiologi mätning av att studera aktiviteten av Electro-Neutral transportörer

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

The method of giant patches combined with ion-selective microelectrodes is a versatile method used to detect and quantify ion fluxes. Specifically, it is used to measure the proton fluxes generated by the activity of the electro-neutral ion transporter, the sodium-hydrogen exchanger or NHE, which is expressed on the cell membrane. The sodium-hydrogen exchanger generates a gradient of protons in close proximity to the plasma membrane, indicated here as an orange ring.This gradient of protons across the cell membrane is measured by whole cell patch clamp recording combined with a technique that uses a proton selective microelectrode. The proton selective microelectrode is moved close to the cell surface, where it records the flux of protons moving out from the cells, shown here in position A.And away from the cell surface, where it records the free proton concentration present in the solution indicated by position B.And then, back to position A, close to the cell membrane, in a repetitive, oscillatory movement. The voltage difference from A to B is recorded and is dependent on the representative of the NHE activity.Transporter ions such as protons across the cell membrane affect process essential to life. Therefore, changes in pH are tightly regulated by an array of molecules, including the sodium-proton exchanger, a plasma membrane proton exclusion system. The oscillating pH microelectrode combined with whole cell patch clamping is a novel approach to study the proton flux mediated by the sodium-proton exchanger activity.Application of this methods overcome some of the major limitation of typically used techniques to measure sodium-proton exchanger activity, such as moderate sensitivity, and time resolution and another good control of the intracellular environment. I will give a demonstration of the methods together with my collaborator, Dr Victor Babich. Dr Matthew Henry will be the narrator.We are going to demonstrate an application of this method by measuring the activity of the sodium-proton exchanger isoform three that is a major regulator of absorption of salt in water across the intestine and renal epithilium. The proton selective microelectrodes for the measurement of the proton concentration are fabricated from standard borosilicated glass tubing. Borosilicate glass electrodes having a 1.2 millimeter external diameter and without filament are pulled with a vertical puller, using a conventional double pull protocol.A pipette tip of two to three micrometers in diameter is obtained. The pipettes are placed in a jar holder with the pipette tip facing up. Next, a mixture is prepared to siliconize the pipettes.It is poured into a jar and the lid is closed tightly. Pipettes are incubated with the siliconization mixture for 24 to 48 hours. Use caution, be sure to prepare the mixture and siliconize the pipettes at room temperature in a well ventilated chemical fumehood.Back fill the pipette with the appropriate ion selective resin and carefully place it vertically in a jar holder with the pipette tip facing down. To prepare for patch clamping, begin by pulling patch clamping pipettes from thin-walled borosilicate glass with an external diameter of two millimeters and internal diameter of 1.4 millimeters in a vertical puller using conventional double pull protocol. Use a microforge mounted on a stage of an inverted microscope to make a wide pipette tip.Position the pipette close to the thick platinum wire of the microforge. Turn on the heat using a foot switch that controls the current on and off. Heat the low melting point glass that covers the middle of the thick platinum wire of the microforge and then move the pipette tip close to the melted soft glass.The heating moves the platinum wire slightly towards the center. The platinum wire returns to the initial position and the pipette tip breaks. Repeat the procedure until the desired tip diameter is obtained and finally, apply heat to smooth the tip.Pipette tips are 10 micrometers in diameter after polishing with the microforge. Using the thick platinum wire is a benefit in that there is little expansion after turning on the electricity and less possibility of overheating the wire and pipette with excessive current. After the cells are dissociated using trypsin and trypsinization is blocked, cells are maintained on a shaker with rocking to prevent formation of clumps.This is done for up to two hours following trypsinization. The electrophysiology set up consists of a temperature controller to regulate the temperature of the solution in the perfusion system. All experiments are performed at about 37 degrees Celsius.And an optical filter switcher to control the filter wheel for fluorescence imaging. A perfusion system valve controller to regulate the opening and closing of the perfusion system valves. And the temperature controller to regulate the temperature of the recording chamber.An oscilloscope to observe waveforms and a patch clamp amplifier. A computer running this Capmeter software. And an electrometer to record ion selective microelectrode signal.And a differential amplifier to amplify the signal of the electrometer. The electrophysiology setup is equipped also with an inverted microscope with stage controller, two micro-manipulators with controllers positioned on the left and right sites of the microscope, the perfusion system with inline solution heater. After the ion selective microelectrode pipette is mounted to the micromanipulator, back fill the patch clamping pipette with the intracellular solution.Make sure that the solution reaches the tip of the pipette. It might require several gentle taps to eliminate bubbles in the tip of the pipette. Then mount the patch clamping pipette to the head stage of the electrophysiology setup.Gently transfer healthy appearing cells to the recording chamber filled with a defined volume of bath solution. It is important to keep the head stage at a 45 degree angle to the horizontal axis. This ensures an entry angle for the pipette that is suitable for the formation of a highly resistant seal.While the patch clamp pipette is lowered in the bath solution, apply a small amount of positive pressure to the pipette to reduce the chance of blocking the tip. Select a cell and approach it with a small amount of positive pressure. Stop moving the patch clamp pipette once the tip is close to the cell.Lower the ion selective microelectrode in the bath solution until it is the same focal plane of the patch clamp pipette tip. When the pipette is centrally positioned over the cell, initiate the seal by applying a small amount of negative pressure. A mega-ohm seal is obtained within a few seconds.Make sure that the holding potential is maintained by the amplifier at zero millivolts. Finally, rupture the cell membrane with a series of short pulses of suction and start the recording. Using the giant patch recording method, it is possible to perfuse solutions rapidly in the glass pipette via an intrapipette perfusion system to modify the intracellular content of ions, lipids, and proteins.Position the ion selective microelectrode pipette close to the cell held by the patch clamp pipette and start the oscillation of the ion selective microelectrode pipette by moving it to and from the cell. Application of this technique allows one to study the molecular regulation of the sodium-hydrogen exchanger. Taking advantage of the giant patches method, the intracellular composition of ATP and lipids was modified by an intrapipette perfusion system.Intracellular perfusion of apyrase, which hydrolyzes intracellular ATP and decreases phosphoinositide content caused a 50%decrease in NHE isoform three activity. The apyrase effect on NHE3 activity was not reversed by intracellular perfusion of the phosphoinositide, PIP2. However, it was reversed by the intracellular perfusion of the phophoinositide, PIP3.Measurement of NHE activity takes advantage of combining the proton selective microelectrode and patch clamping methods. This allows for the study of the molecular basis behind the differential regulation of NHE by phosphoinositides and downstream signal cascades. After watching this video, you should have a good comprehension on how to measure the activity of the sodium-proton exchanger using an oscillating pH microelectrode combined with all cell patch clamping.And an example of possible application of the methods.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Tillämpa Mikrofluidik till elektrofysiologi

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatisk optisk Heartbeat Analys av små hjärtan

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Spinal Cord Electrophysiology

Ryggmärg Elektrofysiologi

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Tillämpning av MassSQUIRM om kvantitativa mätningar av Lysin demetylas aktivitet

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Introduktion till Solid stöds membranbaserad Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Rekonstruktion av 3-dimensionell histologi volym och dess tillämpning att studera Mouse bröstkörtlar

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Hög kapacitet bildanalys av tumör spheroids: Ett användarvänligt program för att mäta storleken på sfäroider automatiskt och korrekt

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Mätning av Larvernas aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetskontroll

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...