Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of Jiangsu provins (BK20140919), National Natural Science Foundation of China (31470375), den prioriterede Program udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner og Qing Lan projekt.

1. forberedelse af planter (8 uger)
<ol><li>Sætte 50 Nicotiana benthamiana frø i en 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende 1 mL 5% NaClO og 0,1% Triton X-100 (V/V) opløsning og henstår i 5 min til at sterilisere frøene.</li>
	<li>Skyl frøene med sterilt vand 5 gange og suspendere frø i 200 µL sterilt vand.</li>
	<li>Omhyggeligt sted enkelte frø på overfladen af MS-agarsubstratet (1 L: 1 x Murashige & Skoog salte, 10 g saccharose, pH 5,8 (KOH), 1% agar) med fine tips og store medium plader i 4 ° C ...

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

Protokollen beskrevet her er simpel og reproducerbar til at studere i vivo protein-protein interaktioner og især egnet til påvisning af protein interaktion dynamics under eksogene behandling. Det vigtigste skridt i denne analyse er N. benthamiana infiltration. For at sikre infiltration succes, skal planter være meget sundt. En anden afgørende faktor er, når at tjekke luciferase aktivitet efter infiltration. Der er ingen korrekt svar på dette spørgsmål. Forskere opfordres til at overvåge lucifer...

For at koordinere vækst med sine omgivelser, har planter udviklet elegante signaling veje for at fornemme, transduce og svare til signalering stikord. Som løbere i et stafetløb er proteiner nødvendige spillere i anlægget signaltransduktion. Det har været almindeligt anerkendt, at protein-protein interaktion (PPI) spiller en stor rolle for cellulære kommunikation. Protein fosforylering, acetylation og nedbrydning er alle afhængige af fysiske samspil mellem et mål protein og dens ændring enzymer. For eksempel, Jasmonate ZIM-domæne protein (JAZ) familie proteiner interagere med transskription faktor MYC2 og undertrykke sin transcriptional aktivitet1,2. I betragtning af betydningen af PPI udforsket storstilet protein interactomes i planter er blevet seneste3,4,5. Disse interactome resultater yderligere afsløre de komplekse regulerende netværk, der koordinerer forskellige cellulære funktioner.
Der er nogle etablerede metoder til overvågning af PPI. Gær to hybrid (Y2H) assay er den mest udbredte metode til registrering af PPI. Y2H er nem at udføre, og egnet til en hurtig test til at undersøge protein interaktioner. Y2H er også almindeligt anvendt til screening ukendt interaktion partnere til specifikke protein-af-interesse. Dog fordi Y2H er helt udført i gær, afspejler ikke det den virkelige scenario i plante-celler og bringer høj falsk positive priser. En anden lignende strategi er pull-down analyse. Generelt er to proteiner udtrykt og renset fra Escherichia coli celler og derefter blandes og immobiliseret til påvisning af protein interaktioner. Selv om denne metode ikke er tidskrævende, kan ikke det skaffe i vivo interaktion resultater enten. I vivo interaktion henblik er co-immunoprecipitation (co-IP) den mest populære assay, som kræver høj kvalitet antistof mod immunoprecipitate protein af interesse og ikke udelukke muligheden for indirekte ppi. Desuden, på grund af de komplicerede eksperimentelle procedurer i co-IP, resultaterne normalt variere med individuelle ekspertise.
Reporter baseret rekonstitution assays forhånd stærkt påvisning af i vivo PPI. Disse metoder omfatter fluorescens resonans energi overførsel (FRET)6, bimolecular fluorescens komplementering (BiFC)7og firefly luciferase komplementering imaging (LCI) assay8. Selv om disse tre tilgange er bedre end co-IP til at afspejle den direkte i vivo PPI, FRET og BiFC har brug for specifikke mikroskoper til at opdage fluorescens signaler og kan ikke nemt kvantificere interaktion intensitet. Derimod udnytter LCI firefly luciferase, hvilket vil glød efter reagerer med sit Bæremateriale luciferin. Endnu vigtigere, kan PPI intensitet bestemmes ud fra værdien af luciferase aktivitet. Således angiver LCI ikke kun om to proteiner interagere eller ikke, men indeholder også oplysninger om interaktion dynamikken på behandling. Selv om der er nogle etablerede metoder til overvågning af interaktion dynamics (baseret på overflade plasmon resonans eller thermo-stabilitet forskydninger)9,10, kræver disse tilgange delikat instrumenter eller specifik mærkning. Derimod er LCI lettere at udføre og opdage.
Princippet for LCI er der i amino-terminal og carboxyl-terminal halvdele af luciferase (opkaldt N-Luc eller C-Luc, henholdsvis) var sammenvokset med protein A og B, og disse to fusion proteiner var samtidig udtrykt i plantecellerne. Hvis protein A interagerer med protein B, derefter rekonstitueres de to halvdele af luciferase for at være en aktiv luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan opdages med en luminometrisk eller CCD-kamera. Det er ikke nødvendigt at opnå stabile transformants for LCI; forbigående udtryk er nok til at få en høj kvalitet interaktion resultat.
RING-type E3 ubiquitin ligase konstitutiv photomorphogenic 1 (COP1) interagerer med et utal af transkriptionsfaktorer og fremmer deres nedbrydning gennem 26S proteasom11. Nogle af disse COP1-målrettet transkriptionsfaktorer er positive tilsynsmyndigheder inden for photomorphogenesis. I mørke interagerer COP1 med suppressor af phytochrome A-105 1 (SPA1), hvilket forbedrer COP1 E3 aktivitet8. Efter opfattelsen af lys, vil fotoreceptorer ophæve COP1-SPA1 interaktionen for at hæmme COP1 aktivitet og derefter stabilisere COP1 substrater12,13,14. Dette eksempel illustrerer den biologiske betydning af at studere PPI og bestemmelse af PPI dynamics.

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

Protein-protein interaktioner er grundlæggende mekanismer for genudlægning signaltransduktion i mest cellulære processer; identifikation af roman protein-protein interaktion par og overvågning protein interaktion dynamics er derfor af særlig interesse for at afsløre, hvordan planter reagere på miljøfaktorer og/eller udviklingsmæssige signaler. Et utal af metoder er blevet udviklet for at undersøge protein-protein interaktioner, enten in vitro eller i vivo. Blandt dem er den nyligt etablerede luciferase komplementering imaging (LCI) assay den enkleste og hurtigste metode til at demonstrere i vivo protein-protein interaktioner. I denne analyse, protein A eller protein B er sammenvokset med i amino-terminal eller carboxyl-terminal halvdel af luciferase, henholdsvis. Når protein A interagerer med protein B, vil de to halvdele af luciferase skal rekonstitueres til at danne en funktionel og aktive luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan registreres med en luminometrisk eller CCD-kamera. Sammenlignet med andre tilgange, viser LCI analysen protein-protein interaktioner, både kvalitativt og kvantitativt. Agrobacterium infiltration i Nicotiana benthamiana blade er et udbredt system for forbigående protein udtryk. Med kombinationen af Lønomkostningsindekset og forbigående udtryk viser disse tilgange, at den fysiske interaktion mellem COP1 og SPA1 blev gradvist reduceret efter jasmonate behandling.

Tre hovedtrin kan fremhæves i denne luciferase komplementering protokol for at studere protein-protein interaktioner i vivo, herunder plantevækst, tobak infiltration og luciferase assay. Det mest afgørende skridt i denne protokol er infiltrerer flydende A. tumefaciens til N. benthamiana blade (figur 1).
Her er et eksempel på nytten af denne teknik, bekræfter jasmonate...

Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase komplementering Imaging Assay i Nicotiana benthamiana blade for forbigående bestemmelse af Protein-protein interaktion Dynamics

Dette manuskript beskriver en nem og hurtig eksperimentel procedure til bestemmelse af protein-protein interaktioner baseret på måling af luciferase aktivitet.

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

En enkel metode til Imaging Arabidopsis Blade Brug Perfluorodecalin som en infiltrativ Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase affinitetsindfangning under anvendelse af magnetiske perler til at studere protein-protein interaktion: poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flow cytometri af bimolekylær Fluorescens Complementation: En High Throughput Kvantitativ metode til at studere protein-protein interaktion

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifikation af protein-protein interaktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Voksen Heads af Tandem Affinitetsrensning (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration og PVX Agroinfection i kartoffel og Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaktioner visualiseret ved bimolekylær Fluorescens komplementering i tobaksprotoplaster og blade

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifikation af protein-protein-interaktion websteder anvendelse af peptid Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...