Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (BK20140919), de nationale Natural Science Foundation van China (31470375), de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu instellingen voor hogeronderwijs en de Qing Lan Project.

1. bereiding van planten (8 weken)
<ol><li>Zet 50 Nicotiana benthamiana zaden in een 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 mL 5% NaClO en 0,1% Triton X-100 (V/V) oplossing en laat gedurende 5 minuten om de zaden te steriliseren.</li>
	<li>Spoel de zaden met steriel water 5 keer en schorten zaden in 200 µL van steriel water.</li>
	<li>Zorgvuldig plaats individuele zaden over het oppervlak van de MS-agar medium (1 L: 1 x Murashige & Skoog zouten, 10 g sacharose, pH 5,8 (KOH), 1% agar) met fijne tips en winkel midde...

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

Het protocol hier beschreven is eenvoudig en reproduceerbare voor het bestuderen van in vivo eiwit-eiwitinteractie en bijzonder geschikt voor het opsporen van eiwit interactie dynamiek onder exogene behandeling. De belangrijkste stap in deze test is N. benthamiana infiltratie. Infiltratie om succes te verzekeren, moet de planten zeer gezond. Een andere belangrijke factor is wanneer luciferase activiteit controleren na infiltratie. Er is geen juiste antwoord voor deze vraag. Onderzoekers worden aangemoed...

Oog op de coördinatie van groei met zijn omgeving, planten geëvolueerd tot elegante signaalroutes om te voelen, transduce en te reageren op signalen van de signalering. Zoals de lopers in een estafette zijn eiwitten nodig spelers in signaaltransductie van planten. Het is algemeen erkend dat eiwit-eiwit interactie (PPI) een belangrijke rol voor mobiele communicatie speelt. Proteïne fosforylatie, acetylation en afbraak zijn allemaal afhankelijk van de fysieke interactie tussen een doel-eiwit en haar wijzigen enzymen. Bijvoorbeeld, Jasmonate ZIM-domein eiwit (JAZ) familie eiwitten interactie met transcriptiefactor MYC2 en onderdrukken zijn transcriptionele activiteit1,2. Gezien het belang van PPI onderzocht grootschalige eiwit interactomes in fabrieken geweest onlangs3,4,5. Deze interactome resultaten verder onthullen de complexe regelgeving netwerk dat coördineert voor diverse cellulaire functies.
Er zijn enkele gevestigde benaderingen voor de controle van de PPI. De bepaling van gist twee hybride (Y2H) is de meest gebruikte methode voor de detectie van de PPI. Y2H is gemakkelijk uit te voeren, en geschikt voor een snelle test onderzocht eiwitinteractie. Y2H wordt ook op grote schaal gebruikt voor de screening van de onbekende wisselwerking partners voor de specifieke eiwit-of-interest. Echter omdat Y2H is geheel uitgevoerd in gist, kan niet zij nadenken het echte scenario in plantaardige cellen en brengt hoge valse positieve tarieven. Een andere soortgelijke strategie is de bepaling van de pull-down. In het algemeen twee eiwitten zijn uitgedrukt en gezuiverd van Escherichia coli cellen en vervolgens gemengd en geïmmobiliseerd voor het opsporen van eiwitinteractie. Hoewel deze methode niet tijdrovend is, niet kan het verkrijgen in vivo interactie resultaten ofwel. Voor in vivo de doeleinden van de interactie is co-immunoprecipitation (co-IP) de meest populaire assay, die houdt van hoge kwaliteit-antistoffen tegen immunoprecipitate de eiwit-of-interest en de mogelijkheid van indirecte PPIs kan niet worden uitgesloten. Bovendien, als gevolg van de ingewikkelde experimentele procedures in co-IP variëren de resultaten meestal met individuele expertise.
Verslaggever gebaseerd reconstitutie testen verder sterk de opsporing van in vivo PPI. Deze methoden omvatten de firefly luciferase complementatie imaging (LCI) assay8, fluorescentie resonance energy transfer (FRET)6en bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC)7. Hoewel deze drie benaderingen beter dan co-IP aan de directe in-vivo PPI, FRET en BiFC specifieke microscopen te detecteren signalen van de fluorescentie moeten en kunnen niet gemakkelijk kwantificeren van de intensiteit van de interactie. LCI maakt daarentegen gebruik van firefly luciferase, die gloeien zal na reageren met haar substraat luciferine. Nog belangrijker, kan PPI intensiteit worden bepaald uit de waarde van luciferase activiteit. LCI geeft dus niet alleen of de twee eiwitten interactie of niet, maar verstrekt ook informatie over de dynamiek van de interactie op een behandeling. Hoewel er enkele gevestigde methoden voor de controle van interactie dynamics (gebaseerd op oppervlakte plasmon resonantie of thermo-stabiliteit verschuivingen)9,10, betekent dit dat deze benaderingen gevoelige instrumenten of specifieke etikettering nodig. LCI is daarentegen eenvoudiger uit te voeren en te detecteren.
Het principe van LCI is dat de amino-terminal en carboxyl-terminal helften van luciferase (genaamd N-Luc of C-Luc, respectievelijk) waren gesmolten met EiwitA en B, en deze twee fusion eiwitten gelijktijdig werden uitgedrukt in plantencellen. Eiwit A communiceert met eiwit B, zal de twee helften van luciferase worden toegevoegd om een actieve luciferase enzym. Luciferase activiteit kan worden opgespoord met een luminometer of CCD-camera. Het is niet nodig voor het verkrijgen van stabiele transformants voor LCI; voorbijgaande expressie is genoeg om een kwalitatief hoogwaardige interactie resultaat te krijgen.
RING-type E3 ubiquitin ligase constitutieve photomorphogenic 1 (COP1) interageert met een horde van transcriptiefactoren en hun afbraak tot en met de 26S proteasoom11bevordert. Sommige van deze COP1-gerichte transcriptiefactoren zijn positieve regelgevers voor photomorphogenesis. In duisternis communiceert COP1 met suppressor van Phytochroom A-105 1 (SPA1), die COP1 E3 activiteit8verbetert. Na waarneming van licht, zal de researchdieren de COP1-SPA1 interactie vervolgens stabiliseren COP1 substraten12,13,14te COP1 activiteit remmen trekt. In het volgende voorbeeld illustreert de biologische betekenis van studeren PPI en het bepalen van de PPI dynamiek.

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

Eiwit-eiwitinteractie zijn fundamentele mechanismen voor het doorgeven van signaaltransductie in meest cellulaire processen; Daarom zijn de identificatie van nieuwe eiwit-eiwit interactie pairs en eiwit interactie dynamiek controle van bijzonder belang voor het openbaren van hoe planten reageren op omgevingsfactoren en/of ontwikkelingsstoornissen signalen. Een overvloed aan benaderingen zijn ontwikkeld voor eiwit-eiwitinteractie, in vitro of in vivoonderzoeken. Onder hen is de onlangs opgerichte luciferase complementatie imaging (LCI) assay de eenvoudigste en snelste methode voor het aantonen van in vivo eiwit-eiwitinteractie. In deze test, is EiwitA of eiwit B gefuseerd met de amino-terminal of carboxyl-terminal helft van luciferase, respectievelijk. Wanneer EiwitA met eiwit B communiceert, zal de twee helften van luciferase worden toegevoegd om te vormen van een functionele en actieve luciferase enzym. Luciferase activiteit kan worden vastgelegd met een luminometer of CCD-camera. In vergelijking met andere benaderingen, toont de LCI assay eiwit-eiwitinteractie zowel kwalitatief als kwantitatief. Agrobacterium infiltratie in Nicotiana benthamiana bladeren is een veelgebruikt systeem voor voorbijgaande eiwit expressie. Met de combinatie van LCI en voorbijgaande expressie tonen deze benaderingen dat de fysieke interactie tussen COP1 en SPA1 geleidelijk was verminderd na de Jasmonaat behandeling.

Drie belangrijke stappen kunnen worden uitgekozen in dit luciferase complementatie protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties in vivo, met inbegrip van de plantengroei, tabak infiltratie en de luciferase assay. De meest cruciale stap in dit protocol is vloeibare A. tumefaciens infiltreren in de N. benthamiana bladeren (Figuur 1).
Hier is een voorbeeld van het nut ...

Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agro-infiltratie en PVX Agro-infectie in aardappel en Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...