Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation sciences naturelles de la Province du Jiangsu (BK20140919), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31470375), la priorité académique programme développement de Jiangsu établissements d’enseignement supérieur et le projet de Lan Qing.

1. préparation des plantes (8 semaines)
<ol><li>Mettre 50 graines de Nicotiana benthamiana dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 1 mL de 5 % NaClO et solution à 0,1 % X-100 Triton (V/V) et laisser pendant 5 min stériliser les graines.</li>
	<li>Rincer les graines à l’eau stérile 5 fois et suspendre les graines dans 200 µL d’eau stérile.</li>
	<li>Soigneusement lieu de graines individuelles sur la surface de la gélose MS (1 L: 1 x sels de Murashige et Skoog, 10 g de saccharose, pH 5,8 (KOH)...

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

Le protocole décrit ici est simple et reproductible pour l’étude in vivo des interactions protéine-protéine et particulièrement adapté pour la détection dynamique d’interaction de protéine sous traitement exogène. L’étape clé de ce dosage est N. benthamiana infiltration. Pour assurer le succès de l’infiltration, les plantes doivent être très sains. Un autre facteur critique est alors de vérifier l’activité de la luciférase après infiltration. Il n’y a aucune bonne réponse ...

Afin de coordonner la croissance avec son environnement, les plantes ont évolué des voies de signalisation élégants pour détecter, transmettre et répondre aux signaux de signalisation. Comme les coureurs dans une course de relais, les protéines sont les joueurs nécessaires dans la transduction du signal plante. Il a été largement reconnu que l’interaction protéine-protéine (PPI) joue un rôle majeur pour la communication cellulaire. Dégradation, l’acétylation et la phosphorylation des protéines sont tout dépendantes de l’interaction physique entre une protéine cible et ses enzymes de modification. Par exemple, les protéines de la famille Jasmonate ZIM-domaine protéique (JAZ) interagissent avec le facteur de transcription MYC2 et suppriment son activité transcriptionnelle1,2. Compte tenu de l’importance du PPI, protéine à grande échelle, interactomes chez les plantes ont été exploré récemment3,4,5. Ces résultats interactome révèlent le réseau réglementaire complexe qui coordonne les diverses fonctions cellulaires.
Il y a certaines approches établies pour le suivi des PPI. La levure deux hybride (Y2H) est la méthode la plus utilisée pour la détection de l’IPP. Y2H est facile à réaliser et adapté pour un test rapide examiner les interactions entre protéines. Y2H est également largement utilisé pour le dépistage des partenaires d’interaction inconnue pour la protéine d’intérêt spécifique. Cependant, parce que Y2H est entièrement réalisé dans la levure, il ne peut pas refléter le scénario réel en usine cellules et apporte la hautes taux de faux positifs. Une autre stratégie semblable est le test de menu déroulant. En général, deux protéines sont exprimées et purifiées à partir de cellules d’Escherichia coli mélangés et immobilisées pour détecter des interactions entre protéines. Bien que cette méthode n’est pas fastidieux, il ne peut obtenir en vivo résultats interaction non plus. Fins en vivo interaction, co-immunoprécipitation (co-IP) est l’analyse plus populaire, ce qui nécessite des anticorps de haute qualité pour l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt et ne peut pas exclure la possibilité des IPP indirecte. En outre, en raison des complexes procédures expérimentales dans co-propriété intellectuelle, les résultats varient généralement avec expertise individuelle.
Essais de reconstitution de journaliste basé avancent considérablement la détection in vivo PPI. Ces méthodes incluent la fluorescence resonance energy transfert (FRET)6, fluorescence bimoléculaire complémentation (BiFC)7et la complémentation de luciférase firefly imaging (LCI) test8. Bien que ces trois approches sont mieux que co-IP afin de refléter le direct en vivo PPI, frette et BiFC besoin spécifiques microscopes pour détecter les signaux de fluorescence et ne peut pas facilement quantifier l’intensité de l’interaction. En revanche, LCI profite de la luciférase firefly, qui s’allume après réaction avec son luciférine de substrat. Plus important encore, intensité de l’IPP peut être déterminée de la valeur de l’activité de la luciférase. Ainsi, LCI indique non seulement si les deux protéines interagissent ou pas, mais fournit également des informations sur la dynamique de l’interaction par traitement. Bien qu’il existe certaines méthodes établies pour surveiller l’interaction dynamique (fondée sur le surface plasmon resonance ou thermo-stabilité)9,10, ces approches nécessitent des instruments délicats ou marquage spécifique. En revanche, LCI est plus facile à réaliser et à détecter.
Le principe pour LCI, c’est que les moitiés amino-terminale et c-terminal de la luciférase (appelé N-Luc ou C-Luc, respectivement) ont été fusionnés avec la protéine A et B ces fusion deux protéines ont été simultanément exprimés dans les cellules végétales. Si A protéine interagit avec la protéine B, alors les deux moitiés de la luciférase vont être reconstituées pour être une enzyme luciférase active. Activité de la luciférase peut être détectée avec une caméra CCD ou un luminomètre. Il n’est pas nécessaire d’obtenir des transformants stables pour LCI ; expression transitoire est suffisant pour obtenir un résultat de l’interaction de haute qualité.
ANNEAU de type E3 ubiquitine ligase photomorphogenic constitutive 1 (COP1) interagit avec une myriade de facteurs de transcription et favorise leur dégradation par le protéasome 26 s11. Certains de ces facteurs de transcription COP1 ciblées sont les régulateurs positifs pour photomorphogenèse. Dans l’obscurité, COP1 interagit avec suppresseur du phytochrome A-105 1 (SPA1), qui améliore la COP1 E3 l’activité8. Après la perception de la lumière, photorécepteurs vont abroger l’interaction COP1-SPA1 pour inhiber l’activité COP1 et ensuite stabiliser COP1 substrats12,13,14. Cet exemple illustre l’importance biologique de l’étudiant PPI et déterminer la dynamique PPI.

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

Interactions protéines-protéines sont des mécanismes fondamentaux pour relayer la transduction du signal dans les processus cellulaires plus ; par conséquent, identification des paires d’interaction protéine-protéine nouvelle et surveillance dynamique d’interaction de protéine sont particulièrement intéressantes pour révéler comment les plantes répondent à des facteurs environnementaux et/ou des signaux du développement. Une multitude d’approches ont été développées afin d’examiner les interactions protéine-protéine, in vitro ou in vivo. Parmi eux, la complémentation de luciférase récemment créée d’imagerie (LCI) est la méthode la plus simple et plus rapide pour avoir démontré in vivo des interactions protéine-protéine. Dans cet essai, la protéine A ou la protéine B est fondue avec la partie amino-terminale ou carboxyl-terminale de la luciférase, respectivement. Lorsque la protéine A interagit avec la protéine B, les deux moitiés de la luciférase vont être reconstitués pour former un enzyme luciférase fonctionnel et actif. Activité de la luciférase peut être enregistrée avec un luminomètre ou une caméra CCD. Par rapport aux autres approches, le dosage LCI montre des interactions protéine-protéine qualitativement et quantitativement. L’infiltration dans les feuilles de Nicotiana benthamiana Agrobacterium est un système largement utilisé pour l’expression de la protéine transitoire. Avec la combinaison de LCI et expression transitoire, ces approches montrent que l’interaction physique entre COP1 et SPA1 a été progressivement réduite après traitement de jasmonate.

Trois étapes principales peuvent être singularisés dans ce protocole de complémentation de luciferase pour l’étude des protéines interactions in vivo, y compris la croissance des plantes, l’infiltration du tabac et le dosage de la luciférase. L’étape la plus cruciale dans le présent protocole est infiltrer liquide a. tumefaciens dans des feuilles de N. benthamiana (Figure 1).
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Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Cet article décrit une procédure expérimentale simple et rapide pour déterminer les interactions protéine-protéine basées sur la mesure de l’activité de la luciférase.

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

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