Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי את מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20140919) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31470375), עדיפות אקדמי תוכנית הפיתוח של ג'יאנגסו מוסדות להשכלה גבוהה, צ'ינג Lan הפרוייקט.

1. הכנת הצמחים (8 שבועות)
<ol><li>הכניסו זרעי benthamiana טבק 50 1.5 mL microcentrifuge שפופרת אחת המכילה 1 מ"ל של 5% NaClO ו- 0.1% טריטון X-100 (וי/V) פתרון ולהשאיר למשך 5 דקות לחטא את הזרעים.</li>
	<li>לשטוף את הזרעים במים סטריליים 5 פעמים, להשעות את הזרעים ב 200 µL של מים סטריליים.</li>
	<li>בזהירות המקום בודדים זרעים על גבי המשט?...

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

פרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, ללמוד ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון, הדירים מתאים במיוחד לגילוי חלבון dynamics אינטראקציה תחת טיפול אקסוגני. הצעד מפתח זה וזמינותו היא חדירה benthamiana ש . כדי להבטיח הצלחה הסתננות, הצמחים להיות בריא מאוד. גורם קריטי נוסף הוא מתי לבדוק פעילות לוציפראז לאחר חד?...

על מנת לתאם צמיחה עם סביבתו, הצמחים התפתחו אלגנטי איתות המסלולים לחוש, מגלי, ולהגיב רמזים איתות. כמו הרצים במירוץ שליחים, חלבונים הם שחקנים הכרחי צמח מעבר אותות. זה הוכרה נרחב אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI) ממלא תפקיד חשוב לקשר סוללרי. זירחון חלבונים, acetylation, והשפלה תלויים כל מגע פיזי בין חלבון המטרה ואנזימים שינוי שלה. לדוגמה, חלבונים משפחה של חלבון (ג'אז) יסמונט צים-תחום אינטראקציה עם גורם שעתוק MYC2, לדכא את פעילות גנים ברמת השעתוק1,2. לאור החשיבות של PPI, חלבון בקנה מידה גדול interactomes בצמחים כבר בחנו לאחרונה3,4,5. תוצאות interactome אלו עוד יותר לחשוף את הרשת רגולטוריות מורכבות מרכזת תאיים מגוונות.
יש כמה גישות הוקמה עבור ניטור PPI. שמרים שני וזמינותו היברידית (Y2H) היא השיטה הנפוצה ביותר לגילוי PPI. Y2H הוא קל לביצוע, מתאים בדיקה מהירה לבדוק אינטראקציות חלבון. Y2H הוא גם משמש לסינון שותפים אינטראקציה לא ידוע עבור ספציפיים החלבון-של-הריבית. עם זאת, מכיוון Y2H מתבצעת לחלוטין בשמרים, זה אינו יכול לשקף התרחיש האמיתי בצמח תאים, מביא תעריפים חיובי כוזב. האסטרטגיה דומה נוספת היא וזמינותו נפתחים. באופן כללי, שני חלבונים הם הביעו מטוהרים מתאי Escherichia coli ו מעורב ואז מתאושש לגילוי אינטראקציות חלבון. למרות ששיטה זו אינה אורכת זמן רב, באפשרותו לקבל ויוו תוצאות האינטראקציה גם. למטרות ויוו אינטראקציה, co-immunoprecipitation (co-IP) הוא וזמינותו הפופולרי ביותר, אשר דורש נוגדן באיכות גבוהה כדי immunoprecipitate החלבון-של-הריבית לא יכול לפסול את האפשרות של להדברה עקיף. יתר על כן, בשל ההליכים ניסויי הסבוכים ב- co-IP, התוצאות בדרך כלל משתנות עם מומחיות בודדים.
מבחני שיחזור כתב מבוסס במידה רבה מראש הזיהוי ויוו PPI. שיטות אלה כוללות פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)6, זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC)7ו את גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה assay (LCI)8. אמנם אלה שלוש גישות יותר co-IP כדי לשקף את ישירה ויוו PPI, סריג, BiFC צריך מיקרוסקופ ספציפי כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית אותות, בקלות לא יכול לכמת את עוצמת האינטראקציה. לעומת זאת, LCI מנצל גחלילית לוציפראז, אשר יווצר מצב לאחר מגיבים luciferin המצע שלה. חשוב יותר, עוצמת PPI יכול להיקבע מהערך של לוציפראז פעילות. לפיכך, LCI מציין לא רק אם שני חלבונים אינטראקציה או לא, אך מספק מידע על הדינמיקות אינטראקציה בעת הטיפול. אמנם יש כמה שיטות הוקמה עבור ניטור אינטראקציה דינמיקה (מבוסס על משטח פלזמון תהודה או תרמו-יציבות משמרות)9,10, גישות אלה דורשות כלים עדינים או תיוג ספציפית. לעומת זאת, LCI קל לבצע ולגלות.
העיקרון של LCI זה החצאים אמינו-מסוף, carboxyl-מסוף של לוציפראז (בשם N-לוק או C-לוק, בהתאמה) היו התמזגו עם חלבון A ו- B, אלה היתוך שני חלבונים היו בו זמנית לידי תאי צמחים. אם חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, להיות מחדש את שני החצאים של לוציפראז להיות אנזים לוציפראז פעיל. לוציפראז פעילות יכול להתגלות עם luminometer או מצלמת CCD. זה לא הכרחי כדי לקבל transformants יציב LCI; הביטוי ארעי מספיקה כדי להשיג תוצאה אינטראקציה באיכות גבוהה.
סוג הטבעת E3 אוביקוויטין ליגאז קונסטיטוטיביות photomorphogenic 1 (COP1) אינטראקציה עם מספר עצום של גורמי שעתוק ומקדם שפלותם דרך ה 26 פרוטאוזום11. כמה גורמי שעתוק, ממוקדות COP1 אלה הם חיוביים לשסתומי פוטומורפוגנזה. באפלה, COP1 מקיים אינטראקציה עם משתיק קול של פיטוכרום A-105 1 (SPA1), אשר מגביר פעילות COP1 E38. לאחר תפיסת האור, photoreceptors ביטל את האינטראקציה COP1-SPA1 לעכב פעילות COP1 ו אז תייצב COP1 סובסטרטים12,13,14. דוגמה זו ממחישה את משמעות ביולוגית לומד PPI וקביעת PPI dynamics.

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

אינטראקציות חלבון-חלבון הם מנגנוני היסוד ממסר אותות ב תהליכים תאיים ביותר; לכן, זיהוי של זוגות אינטראקציית חלבון הרומן וניטור dynamics אינטראקציית חלבון הן עניין מיוחד לחשוף כיצד צמחים מגיבים גורמים סביבתיים ו/או אותות התפתחותית. שפע של גישות פותחו כדי לבדוק אינטראקציות חלבון-חלבון, או בתוך חוץ גופית או ויוו. ביניהם, קומפלמנטציה לוציפראז הוקמה לאחרונה הדמיה (LCI) וזמינותו היא השיטה הפשוטה והמהירה על הפגנת ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון. ב הזה assay, חלבון א' או חלבון B הוא התמזגו עם החצי אמינו-מסוף או carboxyl-מסוף של לוציפראז, בהתאמה. כאשר חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, מחדש את שני החצאים של לוציפראז כדי ליצור אנזים לוציפראז פונקציונלי ופעיל. ניתן לרשום לוציפראז פעילות luminometer או של מצלמות-מצלמה. לעומת גישות אחרות, וזמינותו LCI מראה אינטראקציות חלבון-חלבון איכותית והן באופן כמותי. Agrobacterium חדירה טבק benthamiana העלים היא מערכת בשימוש נרחב עבור ביטוי חלבון ארעית. עם השילוב של LCI וביטוי ארעי, גישות אלה מראים כי האינטראקציה הפיזי בין COP1 SPA1 צומצם בהדרגה לאחר הטיפול יסמונט.

שלושה שלבים עיקריים יכול עכישו ב פרוטוקול קומפלמנטציה זה לוציפראז ללמוד חלבון אינטראקציות בויוו, כולל צימוח, טבק חדירה ואת וזמינותו לוציפראז. הצעד המכריע ביותר פרוטוקול זה הוא חדירה נוזלי tumefaciens א לתוך עלים (ש ע) benthamiana (איור 1).
<p class="jove_conten...

Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...