Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation av Jiangsu provinsen (BK20140919), den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (31470375), prioritet faglig Program utvikling av Jiangsu institusjoner for høyere utdanning og Qing Lan prosjektet.

1. forberedelse av planter (8 uker)
<ol><li>Sette 50 Nicotiana benthamiana frø i en 1,5 mL microcentrifuge tube som inneholder 1 mL av 5% NaClO og 0,1% Triton X-100 (V/V) løsning og la stå i 5 minutter å sterilisere frøene.</li>
	<li>Skyll frøene med sterilt vann 5 ganger og suspendere frø i 200 µL av sterilt vann.</li>
	<li>Nøye sted personlige frø på overflaten av MS-agar medium (1 L: 1 x Murashige & Skoog salter, 10 g sukrose, pH 5,8 (KOH), 1% agar) med fine tips og store medium plater i 4 ° C f...

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

Protokollen beskrevet her er enkel og reproduserbar for å studere i vivo protein-protein interaksjoner, og spesielt egnet for å oppdage protein samhandling dynamics under eksogene behandling. Det viktigste trinnet i denne analysen er N. benthamiana infiltrasjon. For å sikre infiltrasjon suksess, må planter være veldig sunt. En annen viktig faktor er da å sjekke luciferase aktivitet etter infiltrasjon. Det er ingen korrekt svar for spørsmålet. Forskere oppfordres til å overvåke luciferase aktiv...

Samordne vekst med omgivelsene, planter utviklet seg elegante signalveier forstand, transduce og svare på signalnettverk signaler. Som løpere i et relé rase er proteiner nødvendig spillere i anlegget signaltransduksjon. Det har vært anerkjent at protein-protein interaksjon (PPT) spiller en viktig rolle for mobil kommunikasjon. Protein fosforylering, acetylation og fornedrelse er alle avhengige av fysiske samspillet mellom et mål protein og dens endring enzymer. For eksempel Jasmonate ZIM domener protein (JAZ) familie proteiner samhandle med transkripsjon faktor MYC2 og undertrykke sine transcriptional aktivitet1,2. Gitt viktigheten av PPT utforsket store protein interactomes i planter har vært nylig3,4,5. Disse interactome resultatene ytterligere avsløre komplekse regulatoriske nettverket som koordinerer mangfoldig cellulære funksjoner.
Er det noen etablerte metoder for overvåking PPI. Gjær to hybrid (Y2H) analysen er den mest brukte metoden for påvisning av PPT. Y2H er enkel å utføre, og egnet for en rask test for å undersøke protein interaksjoner. Y2H er også mye brukt for screening ukjent samhandling partnere for den bestemte protein-av-begrave. Men fordi Y2H er helt gjennomført i gjær, gjenspeiler ikke det den virkelige situasjonen i anlegget celler og gir høy falske positive priser. En annen lignende strategi er rullegardin analysen. Generelt, er to proteiner uttrykt renset fra Escherichia coli celler og blandet og immobilisert for å oppdage protein interaksjoner. Selv om denne metoden ikke er tidkrevende, det kan ikke hente i vivo samhandling resultatene enten. For i vivo samhandling formål er co-immunoprecipitation (co-IP) mest populære analysen, som krever høy kvalitet mot immunoprecipitate protein-av-begrave og kan ikke utelukke muligheten for indirekte PPIs. Videre, på grunn av kompliserte eksperimentelle prosedyrene i co-IP, resultatene vanligvis varierer med individuelle kompetanse.
Reporteren basert rekonstituering analyser forhånd høyeste gjenkjenning av i vivo PPI. Disse metodene omfatter fluorescens resonans energi overføring (bånd)6, resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC)7og den firefly luciferase complementation imaging (LCI) analysen8. Selv om disse tre tilnærminger er bedre enn co-IP for å reflektere den direkte i vivo PPT, bånd og BiFC trenger bestemte mikroskop å oppdage fluorescens signaler og kan ikke lett kvantifisere samhandling intensiteten. Derimot utnytter LCI firefly luciferase, som vil lyse etter reagere med sin substrat luciferin. Enda viktigere, kan PPI intensitet bestemmes fra verdien for luciferase aktivitet. Dermed angir LCI ikke bare om to proteiner samhandle eller ikke, men gir også informasjon om interaksjon dynamikken på behandling. Selv om det er noen etablerte metoder for overvåking samhandling dynamics (basert på overflaten plasmon resonans eller thermo-stabilitet Skift)9,10, krever disse metodene ømfintlige instrumenter eller bestemte merking. LCI er derimot enklere å utføre og oppdage.
Prinsippet LCI er at amino-terminal og carboxyl-terminal halvdelene av luciferase (kalt N-Luc eller C-Luc, henholdsvis) var smeltet sammen med protein A og B, og disse to fusion proteiner ble samtidig uttrykt i anlegget celler. Hvis protein A samhandler med protein B, vil de to halvdelene av luciferase rekonstitueres for å være et aktivt luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan oppdages med luminometer eller CCD-kameraet. Det er ikke nødvendig å få stabile transformants for LCI; forbigående uttrykket er nok til å ha et høykvalitets samhandling som resultat.
RING-type E3 ubiquitin ligase grunnleggende photomorphogenic 1 (COP1) samhandler med en myriade av transkripsjonsfaktorer og fremmer deres fornedrelse gjennom 26S proteasome11. Noen av disse COP1 målrettede transkripsjonsfaktorer er positiv regulatorer for photomorphogenesis. I mørket samhandler COP1 med suppressor av phytochrome A-105 1 (SPA1), som forbedrer COP1 E3 aktivitet8. Etter oppfatning av lys, vil fotoreseptorer oppheve COP1-SPA1-samhandling for å hemme COP1 aktivitet og deretter stabilisere COP1 underlag12,13,14. Dette eksemplet illustrerer biologiske betydningen av studere PPT og bestemme PPI dynamics.

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

Protein-protein interaksjoner er grunnleggende mekanismer for videresending signaltransduksjon i mest cellulære prosesser; Identifikasjon av roman protein-protein samhandling par og overvåking protein samhandling dynamics er derfor av særlig interesse for å avsløre hvordan planter reagerer på miljømessige faktorer og/eller utviklingsmessige signaler. En mengde tilnærminger har blitt utviklet for å undersøke protein-protein interaksjoner, enten i vitro eller i vivo. Blant dem er den nylig etablerte luciferase complementation imaging (LCI) analysen den enkleste og raskeste metoden for å demonstrere i vivo protein-protein interaksjoner. I denne analysen, protein A eller protein B er smeltet sammen med den amino-terminal eller carboxyl-terminal delen av luciferase, henholdsvis. Når protein A samhandler med protein B, vil de to halvdelene av luciferase rekonstitueres for å danne en funksjonell og aktive luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan registreres med en luminometer eller CCD-kameraet. Sammenlignet med andre tilnærminger, viser LCI analysen protein-protein interaksjoner både kvalitativt og kvantitativt. Agrobacterium infiltrasjon i Nicotiana benthamiana blader er en mye brukt system for forbigående protein uttrykk. Med en kombinasjon av LSI og forbigående uttrykk viser disse metodene at det fysiske samspillet mellom COP1 og SPA1 ble gradvis redusert etter jasmonate behandling.

Tre hovedtrinn kan bli blinket ut i denne luciferase complementation protokollen for å studere protein-protein interaksjoner i vivo, inkludert plantevekst, tobakk infiltrasjon og luciferase analysen. Det mest avgjørende skrittet i denne protokollen er infiltrert flytende A. tumefaciens til N. benthamiana blader (figur 1).
Her er et eksempel på nytten av denne teknikken ...

Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging analysen i Nicotiana benthamiana blader for Transiently bestemme Protein-protein samhandling Dynamics

Dette manuskriptet beskriver en enkel og rask eksperimentelle prosedyren for å bestemme protein-protein interaksjoner basert på måling av luciferase aktivitet.

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

En enkel metode for Imaging Arabidopsis Gir hjelp Perfluorodecalin som et infiltrerende Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase Affinity Capture Assay hjelp av magnetiske perler å studere protein-Protein Interaction: Den poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation: En høy gjennomstrømning Kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifisere Protein-protein samhandling i<em&gt; Drosophila</em&gt; Voksen Heads av Tandem Affinitetsrensing (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrasjon og PVX Agroinfection i Potet og Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaksjoner visualisert ved bimolekylær fluorescens complementation i Tobakk Protoplaster og blader

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifisere Protein-protein interaksjons nettsteder Bruke Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...