Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00
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Este trabalho foi financiado pela Fundação ciência Natural da província Jiangsu (BK20140919), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (31470375), a prioridade acadêmica programa desenvolvimento de Jiangsu instituições de ensino superior e projeto de Lan Qing.

1. preparação de plantas (8 semanas)
<ol><li>Colocar 50 sementes de Nicotiana benthamiana em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 1 mL de 5% NaClO e solução de 0,1% Triton X-100 (V/V) e deixar por 5 min esterilizar as sementes.</li>
	<li>Lave as sementes com água esterilizada 5 vezes e suspender as sementes em 200 µ l de água estéril.</li>
	<li>Cuidadosamente o lugar individual sementes na superfície do MS-ágar-ágar (1 l: 1 x Murashige & Skoog sais, 10 g de sacarose, pH 5,8 (KOH), 1% de...

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

O protocolo descrito aqui é simples e reproduzíveis para estudar na vivo interações da proteína-proteína e particularmente adequado para a detecção dinâmica da interação da proteína sob tratamento exógeno. A etapa chave neste ensaio é infiltração N. benthamiana . Para garantir o sucesso de infiltração, as plantas devem ser muito saudáveis. Outro fator crítico é quando verificar a actividade do luciferase após infiltração. Não há nenhuma resposta correta para esta questão. Os i...

A fim de coordenar o crescimento com seu ambiente, as plantas evoluíram elegantes vias de sinalização para sentir, transduce e responder a sinais de sinalização. Como os corredores em uma corrida de revezamento, as proteínas são necessários jogadores na transdução de sinal da planta. Foi amplamente reconhecido que a interação da proteína-proteína (PPI) desempenha um papel importante para a comunicação celular. Degradação, acetilação e fosforilação de proteínas são todos dependentes da interação física entre uma proteína do alvo e suas enzimas modificando. Por exemplo, Jasmonate ZIM-domínio da proteína (JAZ) família proteínas interage com um factor de transcrição MYC2... e suprimir sua atividade transcricional1,2. Dada a importância do PPI, proteínas em grande escala interactomes em plantas têm sido recentemente exploraram3,4,5. Estes resultados interactome mais revelam a complexa rede de regulamentação que coordena diversas funções celulares.
Existem algumas abordagens estabelecidas para o monitoramento de PPI. O fermento dois híbridos (Y2H) é o método mais utilizado para a deteção de PPI. Y2H é fácil de executar e apropriado para um teste rápido examinar interações da proteína. Y2H é também amplamente utilizado para a seleção de parceiros de interação desconhecida para o proteína de interesse específico. No entanto, porque Y2H é inteiramente realizado em fermento, ele não pode refletir o cenário real em planta células e traz altas taxas de falsas positivas. Outra estratégia semelhante é o ensaio de suspenso. Em geral, duas proteínas são expressas e purificadas de células de Escherichia coli misturadas e imobilizadas para detectar interações da proteína. Embora este método não é demorado, isso não é possível obter na vivo resultados de interação também. Para fins de interação na vivo , co-imunoprecipitação (co-IP) é o ensaio mais popular, que exige o anticorpo de alta qualidade para immunoprecipitate o proteína de interesse e não pode excluir a possibilidade de IPP indireta. Além disso, devido os procedimentos experimentais complicados em co-IP, os resultados geralmente variam com a experiência individual.
Ensaios de reconstituição do repórter baseado grandemente avançam a detecção de na vivo PPI. Estes métodos incluem fluorescência ressonância energia transferência (FRET)6, fluorescência bimolecular complementação (BiFC)7e a complementação de luciferase de vaga-lume de imagem (ICM) ensaio8. Embora essas três abordagens são melhor do que co-IP para refletir o direto na vivo PPI, FRET e BiFC precisam de microscópios específicos para detectar sinais de fluorescência e facilmente não podem quantificar a intensidade de interação. Em contraste, a LCI tira proveito da luciferase de vaga-lume, que irá brilhar após reagir com sua Luciferina de substrato. Mais importante, intensidade PPI pode ser determinada do valor da atividade de luciferase. Assim, a LCI não só indica se duas proteínas interagem ou não, mas também fornece informações sobre a dinâmica de interação com o tratamento. Embora existam alguns métodos estabelecidos para monitorar a interação dinâmica (baseada em turnos de ressonância ou thermo-estabilidade de plasmon de superfície)9,10, essas abordagens requerem instrumentos delicados ou rotulagem específica. Em contraste, a LCI é mais fácil de executar e detectar.
O princípio para a LCI é que as metades amino-terminal e carboxila-terminal de luciferase (chamado N-Luc ou C-Luc, respectivamente) foram fundidos com a proteína A e B e estes dois fusion proteínas simultaneamente foram expressos em células vegetais. Se A proteína interage com a proteína B, então, as duas metades da luciferase vão ser reconstituídas para ser uma enzima luciferase ativo. Atividade do luciferase pode ser detectada com um luminómetro ou CCD da câmera. Não é necessário obter transformants estável para LCI; expressão transiente é suficiente para obter um resultado de interação de alta qualidade.
ANEL-tipo E3 ubiquitina ligase constitutiva photomorphogenic 1 (COP1) interage com uma miríade de fatores de transcrição e promove sua degradação através do Proteassoma 26S11. Alguns desses fatores de transcrição COP1-alvo são os reguladores positivos para Fotomorfogénese. No escuro, COP1 interage com supressor de fitocromo A-105 1 (SPA1), que aumenta a atividade de E3 COP18. Após a percepção de luz, fotorreceptores irão revogar a interação COP1-SPA1 para inibir a atividade COP1 e depois estabilizar COP1 substratos12,13,14. Este exemplo ilustra a importância biológica da PPI a estudar e determinar a dinâmica do PPI.

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

Interações da proteína-proteína são mecanismos fundamentais para a retransmissão de transdução de sinal em processos mais celulares; Portanto, a identificação dos pares de interação da proteína-proteína do romance e monitoração dinâmica da interação da proteína são de particular interesse por revelar como as plantas respondem a fatores ambientais e/ou sinais do desenvolvimento. Uma infinidade de abordagens foram desenvolvidas para examinar as interações da proteína-proteína, seja in vitro ou em vivo. Entre eles, a complementação de luciferase recentemente estabelecida de imagem (ICM) ensaio é o método mais simples e mais rápido para demonstrar na vivo interações da proteína-proteína. Neste ensaio, proteína ou proteína B está fundida com a metade de amino-terminal ou carboxila-terminal de luciferase, respectivamente. Quando a proteína A interage com a proteína B, as duas metades da luciferase vão ser reconstituídas para formar uma enzima luciferase funcional e activa. Atividade do luciferase pode ser gravada com um luminómetro ou CCD da câmera. Em comparação com outras abordagens, o ensaio LCI mostra interações da proteína-proteína, tanto qualitativa como quantitativamente. Infiltração de Agrobacterium em folhas de Nicotiana benthamiana é um sistema amplamente utilizado na expressão de proteínas transitória. Com a combinação de LCI e expressão transiente, essas abordagens mostram que a interação física entre COP1 e SPA1 foi gradualmente reduzida após o tratamento jasmonate.

Três etapas principais podem ser apontadas no presente protocolo de complementação do luciferase para o estudo da proteína-proteína interações na vivo, incluindo o crescimento das plantas, infiltração de tabaco e o ensaio de luciferase. A etapa mais crucial neste protocolo está infiltrando líquido a. tumefaciens em folhas de s. benthamiana (Figura 1).
Aqui está...

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Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Este manuscrito descreve um procedimento experimental de fácil e rápido para determinar interações da proteína-proteína, baseadas na medição da atividade de luciferase.

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Research

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