Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Эта работа была поддержана естественных наук фонд провинции Цзянсу (BK20140919), Национальный фонд Китая естественных наук (31470375), приоритет академические программы развития Цзянсу высших учебных заведений и Цин Интернет проекта.

1. Подготовка растений (8 недель)
<ol><li>Положите 50 Nicotiana benthamiana семян в одной из труб microcentrifuge 1,5 мл, содержащих 1 мл 5% NaClO и 0,1% раствор Тритон X-100 (V/V) и оставить на 5 минут, чтобы стерилизовать семена.</li>
	<li>Сполосните семена с стерильной водой 5 раз и приостановить семена в 200 мкл стерильной ...

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

Протокол, описанные здесь простой и воспроизводимый для изучения в естественных условиях белок белковых взаимодействий и особенно подходит для выявления динамики взаимодействия белков под экзогенными лечения. Ключевым шагом в этот assay является проникновение N. benthamiana . Для о?...

Для того, чтобы координировать роста с окружающей средой, растения эволюционировали элегантный сигнальные пути чувство, передают и реагировать сигнализации сигналы. Как бегунов в эстафете белки являются необходимыми игроков в сигнальной трансдукции растений. Было широко признано, что взаимодействия протеин протеина (PPI) играет важную роль для сотовой связи. Все зависит от физического взаимодействия между целевого белка и его модификация ферментов фосфорилирование белков, ацетилирования и деградации. Например Жасмонат зим домен белка (JAZ) семьи белки взаимодействуют с транскрипционным фактором MYC2 и подавить его транскрипционный анализ активности1,2. Учитывая важное значение PPI крупномасштабные белков, которые были interactomes в растениях изучить недавно3,4,5. Эти interactome результаты далее свидетельствуют о сложных регулирования сети, которая координирует различные клеточные функции.
Есть некоторые установленные подходы для наблюдения за PPI. Assay дрожжей два гибридных (Y2H) является наиболее широко используемым методом для обнаружения PPI. Y2H легко выполнить и подходит для быстрой проверки для изучения взаимодействия протеина. Y2H также широко используется для скрининга неизвестные взаимодействия партнеров для определенного протеина интереса. Однако потому что Y2H полностью осуществляется в дрожжи, он не может отражать реальный сценарий в заводе клетки и приносит высокий уровень ложных положительных. Еще одна аналогичная стратегия является выпадающее assay. В общем две белки являются выразил и очищенного от клеток Escherichia coli и затем смешанные и прикол для обнаружения взаимодействия протеина. Хотя этот метод не требует много времени, он не может получить в естественных условиях результаты взаимодействия либо. Для целей взаимодействия в естественных условиях co иммунопреципитация (co-IP) является наиболее популярным assay, которое требует высокого качества антитела к immunoprecipitate протеин интереса и нельзя исключать возможность косвенного ИЦП. Кроме того из-за сложных экспериментальных процедур в co-IP, результаты обычно зависит от индивидуального опыта.
Журналистом воссоздание анализов сильно заранее обнаружения в vivo PPI. Эти методы включают в себя флуоресценции резонанс энергии передачи (ЛАДА)6, bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ)7и Светлячок Люцифераза дополнения изображений (LCI) пробирного8. Хотя эти три подхода являются лучше, чем co-IP отразить непосредственно в vivo PPI, ладу и БМФЦ нужны конкретные микроскопы для обнаружения сигналов флуоресценции и не может легко количественно интенсивности взаимодействия. В отличие от LCI использует Светлячок Люцифераза, которая будет светиться после реакцию с его люциферин субстрата. Что еще более важно PPI интенсивности может быть определена из значения Люцифераза деятельности. Таким образом LCI не только указывает ли две белки взаимодействовать или нет, но также предоставляет информацию о динамике взаимодействия после лечения. Хотя есть некоторые установленные методы для контроля взаимодействия динамики (на основе поверхностного плазмон резонанса или термо стабильность смены)9,10, эти подходы требуют чувствительные инструменты или конкретных маркировки. В отличие от LCI легче выполнить и обнаружить.
Принцип для LCI это амино- и карбоксильной терминал половинки Люцифераза (называется N-Люк или C-люк, соответственно) были слиты с протеин A и B и эти два синтез белков одновременно были выражены в клетках растений. Если протеин A взаимодействует с белком B, затем две половинки Люцифераза будет преобразован для активного Люцифераза фермента. Люцифераза активности могут быть обнаружены с помощью люминометра или ПЗС камеры. Это не является необходимым для получения стабильной трансформантов для LCI; переходных выражение является достаточно, чтобы получить результат высокого качества взаимодействия.
КОЛЬЦО типа E3 убиквитин лигаза учредительного photomorphogenic 1 (КС1) взаимодействует с множеством факторов транскрипции и способствует их деградации через 26S протеасом11. Некоторые из этих факторов транскрипции, ориентированные на КС1 являются положительные регуляторы для photomorphogenesis. В темноте КС1 взаимодействует с супрессорной фитохрома A-105 1 (SPA1), который повышает КС1 E3 деятельности8. После восприятие света фоторецепторов будет отменить взаимодействие КС1-SPA1 ингибируют активность КС1 и затем стабилизировать КС1 субстратов12,,1314. Этот пример иллюстрирует биологическое значение изучения ИЦП и определение динамики PPI.

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

Белок белковых взаимодействий являются основополагающие механизмы для передачи сигнала в наиболее клеточных процессов; Таким образом идентификация мониторинга динамики взаимодействия белков и Роман протеин взаимодействия пары представляют особый интерес для выявления как растения реагируют на факторы окружающей среды и/или развития сигналов. Множество подходов были разработаны для изучения взаимодействия протеин протеина, в vitro или в естественных условиях. Среди них недавно созданной Люцифераза комплементарности изображений (LCI) пробирного является простой и быстрый метод для демонстрации в естественных условиях белок белковых взаимодействий. В этот assay белок или белков B сливается с амино терминал или карбоксильных терминал половины Люцифераза, соответственно. Когда белок взаимодействует с белком B, две половинки Люцифераза будет преобразован для формирования функциональных и активных Люцифераза фермента. Люцифераза активности могут быть записаны с помощью люминометра или ПЗС камеры. По сравнению с другими подходами, LCI assay показывает белок белковых взаимодействий, как качественно, так и количественно. Agrobacterium инфильтрации в листьях Nicotiana benthamiana является широко используемой системой для переходных белков. С сочетание LCI и переходных выражения эти подходы показывают, что физическое взаимодействие между КС1 и SPA1 было постепенно сокращено после Жасмонат лечения.

В этом протоколе Люцифераза дополнения для изучения белок белковых взаимодействий в естественных условиях, в том числе рост растений, проникновения табака и пробирного Люцифераза можно выделить три основных этапа. Наиболее важным шагом в этом протоколе проникн?...

Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина

Эта рукопись описывает простой и быстрый экспериментальной процедуры для определения белок белковых взаимодействий на основе измерения Люцифераза деятельности.

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Вирус-индуцированные генов (VIGS) в Nicotiana benthamiana И томатный

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC) Пробирной для белок-белковые взаимодействия в Лук ячеек с использованием генной пушки Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Изображениями белок-белковых взаимодействий В естественных условиях</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Простой метод для работы с изображениями Arabidopsis Листья Использование Perfluorodecalin как инфильтративный Средний изображений

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Жидкая фаза Affinity Capture методом с использованием магнитных шариков по изучению белок-белковые взаимодействия: Полиовирус-нанотела Пример

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Определение белок-белковых взаимодействие в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Взрослые Главы по Tandem аффинной очистки (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Агроинфильтрация и PVX Агроинфекция в картофель и Никотиана бентамиана

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Выявление белок-белковых сайтов взаимодействие по пептидов массивов

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...