Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Bu eser Jiangsu eyaleti doğal Bilim Vakfı (BK20140919), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31470375), öncelik akademik Program Geliştirme, Jiangsu yükseköğretim kurumları ve Qing Lan proje tarafından desteklenmiştir.

1. bitki (8 hafta) hazırlanması
<ol><li>%5 NaClO ve % 0.1 Triton X-100 (V/V) çözüm ve bırak tohumlar sterilize etmek 5 min için 1 mL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 50 Nicotiana benthamiana tohum koymak.</li>
	<li>5 kez tohum steril su ile durulayın ve tohum steril su 200 µL içinde askıya alma.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde yer bireysel tohum ince ipuçları ve çimlenme eşitlemek 3 gün boyunca 4 ° C'de mağaza orta plakaları ile MS-agar orta (1 l (KOH), 1 x Murashige & Skoog t...

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

Burada açıklanan basit ve in vivo protein-protein etkileşimleri çalışmak için tekrarlanabilir ve protein etkileşim dynamics eksojen tedavi altında tespit için özellikle uygun protokolüdür. Bu tahlil anahtar i. benthamiana infiltrasyon adımdır. İnfiltrasyon başarılı olmasını sağlamak için bitkiler çok sağlıklı olması gerekir. Bir başka önemli faktör luciferase aktivite infiltrasyon sonra kontrol etmek ne zaman olacağı. Doğru cevap bu soru için vardır. Araştırmacılar...

Büyüme çevresi ile koordine etmek için bitkiler hissediyorum, transduce ve sinyal yardımlar için yanıt vermek için zarif sinyal yolları gelişmiştir. Bir bayrak yarışı kaçakçıları gibi bitki sinyal iletimi gerekli oyuncu proteinlerdir. Bu yaygın olarak protein-protein etkileşim (PPI) hücresel iletişim için önemli bir rol oynar kabul edilmiştir. Protein fosforilasyon, asetilasyon ve yıkımı tüm hedef protein ve onun değiştirme enzimler arasında fiziksel etkileşim bağlıdır. Örneğin, Jasmonate ZIM-etki alanı protein (JAZ) aile proteinler transkripsiyon faktörü MYC2 ile etkileşim ve onun transkripsiyon etkinlik1,2bastırmak. ÜFE önemi göz önüne alındığında, büyük ölçekli protein interactomes tesislerinde olmuştur son zamanlarda3,4,5araştırdı. Bu interactome sonuçlar daha da çeşitli hücresel fonksiyonları koordinatları karmaşık düzenleyici ağ ortaya koyuyor.
ÜFE izlemek için kurulan bir yaklaşım vardır. Maya iki hibrid (Y2H) tahlil PPI algılama için en çok kullanılan yöntemdir. Y2H yapmak kolay ve protein etkileşimlerini incelemek hızlı bir test için uygundur. Y2H bilinmeyen etkileşim ortakları belirli protein-in-faiz için eleme için de yaygın olarak kullanılır. Y2H tamamen Maya gerçekleştirilir çünkü ancak, bu gerçek senaryo bitki hücreleri ve yüksek yanlış pozitif oranları getiriyor yansıtmak değil. Başka bir strateji açılan tahlil olduğunu. Genel olarak, iki protein ifade edilen Escherichia coli hücrelerden saf ve karışık ve protein etkileşimleri algılamak için immobilize. Bu yöntem zaman alıcı olmasa da, bu vivo içinde etkileşim sonuçları da elde edemiyor. Vivo etkileşim, co-immunoprecipitation (co-IP) yüksek kalite antikor immunoprecipitate protein ilgi gerektirir ve dolaylı PPIs olasılığı dışlayamazsınız en popüler tahlil amaçlıdır. Ayrıca, co-IP karmaşık deneysel prosedürler nedeniyle sonuçlar genellikle bireysel uzmanlığı ile farklı.
Muhabir dayalı sulandırma deneyleri büyük ölçüde vivo içinde PPI tespiti ilerlemek. Bu yöntemler Floresans rezonans enerji transferi (FRET)6, bimolecular floresan uluslara (BiFC)7ve (LCI) tahlil8Imaging ateş böceği luciferase uluslara içerir. Bu üç yaklaşım olmasına rağmen daha iyi co-IP doğrudan vivo içinde yansıtmak için PPI, perde ve BiFC floresan sinyallerini algılamak için özel mikroskoplar gerekir ve kolayca etkileşim yoğunluğunu ölçmek olamaz. Buna ek olarak, LCI, substrat biyoluminesans ile tepki sonra parlayan ateş böceği luciferase yararlanır. Daha da önemlisi, ÜFE yoğunluk luciferase aktivite değerinden belirlenebilir. Böylece, LCI sadece iki protein etkileşim veya değil, ancak aynı zamanda tedavi üzerine etkileşim dinamikleri hakkında bilgiler sağlar olup olmadığını gösterir. Etkileşim (yüzey plasmon rezonans veya termo-istikrar vardiyalara göre) dynamics9,10, izlemek için kurulan bir yöntem olmakla bu yaklaşımlar hassas aletler veya belirli etiketleme gerektirir. Buna ek olarak, LCI gerçekleştirmek ve bulmak kolaydır.
LCI prensip luciferase (N-Luc veya C-Luc, sırasıyla adlı) amino-terminal ve karboksil-terminal yarısı bu protein A ve B ve proteinlerin aynı anda bitki hücrelerinde ifade bu iki füzyon ile erimiş. Protein A protein B ile etkileşim, luciferase iki yarısı bir etkin luciferase enzim olmak yeniden. Luciferase faaliyet luminometer veya CCD kamera ile tespit edilebilir. LCI için kararlı transformants elde etmek gerekli değildir; geçici ifade bir yüksek kaliteli etkileşim sonuç almak için yeterlidir.
HALKA tipi E3 Ubikuitin ligaz bünye photomorphogenic 1 (COP1) transkripsiyon faktörleri sayısız ile etkileşim ve onların bozulması-26S proteasome11teşvik etmektedir. Bu COP1 hedefli transkripsiyon faktörlerin bazıları olumlu düzenleyiciler, photomorphogenesis için. Karanlıkta, COP1 phytochrome A-105 1 (SPA1), COP1 E3 etkinlik8artırır bastırıcı ile etkileşime girer. Sonra algı ışık photoreceptors COP1 etkinliği inhibe ve COP1 yüzeylerde12,13,14stabilize etmek üzere COP1-SPA1 etkileşimi iptal etmek. Bu örnek eğitimi PPI ve ÜFE dynamics belirleme biyolojik önemi gösterir.

<table style="border-collapse:collapse;width:686pt" width="915">
	<colgroup>
		<col style="width:293pt" width="390" />
		<col style="width:140pt" width="186" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:114pt" width="152" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Transformation solution</td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl16" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td style="width:114pt" width="152"></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">27.8 mM Glucose</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl18" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">10 mM MgCl2&#215;6H2O</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">150 &#956;M Acetosyringone</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">ALDRICH</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">D134406&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">pH 5.7</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl16" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">Luciferin working buffer</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186"></td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56" style="height:42.0pt">
			<td class="xl17" height="56" style="width:293pt;height:42.0pt" width="390">5 mM Luciferin potassium salt</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28" style="height:21.0pt">
			<td class="xl17" height="28" style="width:293pt;height:21.0pt" width="390">0.025% Triton X-100</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="186">VETEC</td>
			<td class="xl17" style="width:140pt" width="187">V900502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32" style="height:24.0pt">
			<td class="xl17" height="32" style="width:293pt;height:24.0pt" width="390">H2O to 10 ml</td>
			<td class="xl21"></td>
			<td class="xl21"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

Protein-protein etkileşimleri sinyal iletimi en hücresel süreçler içinde geçişi için temel mekanizmaları vardır; Bu nedenle, kimliği roman protein-protein etkileşim çiftleri ve protein etkileşim dynamics izleme nasıl bitkiler çevresel faktörler ve/veya gelişimsel sinyalleri yanıt ifşa için özel ilgi vardır. Yaklaşımlar bir bolluk içinde vitro veya vivo içindeprotein-protein etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir. Bunlar arasında Imaging (LCI) yeni kurulan luciferase uluslara tahlil vivo içinde protein-protein etkileşimleri gösteren için en basit ve en hızlı yöntemdir. Bu tahlil, protein A veya protein B luciferase, amino-terminal veya karboksil-terminal yarısı ile sırasıyla eritilmiş olan. Protein A protein B ile etkileşim kurduğunda, luciferase iki yarısı fonksiyonel ve aktif luciferase enzim oluşturmak için yeniden. Luciferase faaliyet luminometer veya CCD kamera ile kaydedilebilir. Diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, LCI tahlil hem nitelik hem de nicelik protein-protein etkileşimleri gösterir. Agrobacterium infiltrasyon Nicotiana benthamiana yaprakları geçici protein ifade için yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. LCI ve geçici ifade kombinasyonu ile COP1 ve SPA1 arasındaki fiziksel etkileşimi jasmonate tedaviden sonra yavaş yavaş düşürülmüştür bu yaklaşımlar göster.

Üç büyük adım protein-protein etkileşimleri vivobitki büyüme, tütün infiltrasyon ve luciferase tahlil de dahil olmak üzere, eğitim için bu luciferase uluslara protokolündeki saydı. Bu iletişim kuralı en önemli adımda sıvı A. tumefaciens i. benthamiana yaprakları (şekil 1) sızmak.
İşte jasmonate COP1-SPA1 etkileşimleri azaltarak onaylayan bu tekni...

Watch this Scientific Journal Video about Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics at JoVE.com

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...