Name: establishing a mouse model of a pure small fiber neuropathy with the ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1
Uploaded: 2018-02-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1 at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra ministeriet for videnskab og teknologi (106-2320-B-037-024), Kaohsiung medicinske universitet (KMU-M106028, KMU-S105034) og mål for Top universiteter Grant (TP105PR15), Kaohsiung medicinske universitet, Taiwan.

Alle procedurerne er i overensstemmelse med etiske retningslinjer for laboratoriet dyr30, og protokollen er blevet godkendt af de dyr Udvalget af Kaohsiung medicinske universitet, Kaohsiung, Taiwan.
1. etablering af RTX neuropati
Forsigtighed: RTX er neurotoksiske og farlige. På kontakt virker det irriterende på øjne, slimhinder og øvre luftveje. Undgå indånding og bære lab briller og frakker under RTX forberedelse. Skyl...

Virkningsfuldt terapi af lille fiber neuropati i klinikken er nødvendig for at fremme funktionel genopretning og livskvalitet for patienterne. I øjeblikket, er der mangel på en terapeutisk vejledning målretning sensorisk forstyrrelse forbundet med lille fiber neuropati skyldes manglende forståelse for de molekylære mekanismer bag lille diameter neuronal skade. Tidligere modeller af neuropati påvirket normalt både store - og lille diameter sensoriske nerver; for eksempel, modellerne af kemoterapi-induceret neuropa...

Lille fiber neuropati med neuropatisk smerte, hvilket er tydeligt af degeneration af IENFs, er fælles i forskellige former for betingelser, såsom DM, og som følge af de neurotoksiske virkninger af kemoterapeutika1,2, 3,4,5. IENFs er lille diameter neuroner beliggende i dorsalrodsganglier (DRG) perifere terminaler, og påvirkes parallelt i tilfælde af IENF degeneration6. For eksempel, er den ændrede opstrøms genetiske transskription af neuronal somata blevet påvist ved opregulering af aktivering transskription faktor-3 (ATF3)6,7. Desuden er evaluering af IENFs innervation med hudbiopsi nyttig til diagnosticering af lille fiber neuropati5,8,9. Traditionelt, har profiler af IENFs på hudbiopsi afhang af immunhistokemisk påvisning af protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Tilsammen, de patologiske profiler af DRG og IENFs afspejler funktionelle tilstand underliggende lille fiber neuropati og kan være en indikator for de funktionelle konsekvenser af denne type af neuropati på lille diameter neuroner.
Tidligere, flere eksperimentelle modeller har behandlet spørgsmålet om IENF degeneration i tilfælde af kemoterapi-induceret neuropati12,13 og nerve skade forårsaget af kompression eller transection14,15 , 16. disse eksperimentelle modeller også påvirket store diameter nerver; Det var derfor ikke muligt at udelukke bidrag af berørte store diameter nerver i observerede lille fiber neuropati; for eksempel, afhænger behandlingen af thermosensation lidelse af skadelige tilbagetrækning funktionelle motor nervefibre17,18,19. Således, om oprettelse af en ren lille fiber neuropati model og systematisk undersøger den patologiske status af både neuronal somata og deres perifere kutane nervefibre i lille diameter neuroner er nødvendig og afgørende.
RTX er en capsaicin analoge og en potent agonist til forbigående receptor potentielle vanilloid receptor 1 (TRPV1), der medierer nociceptive forarbejdning20,21,22. For nylig perifere RTX behandling lettet neurogen smerte23,24,25 , og en intraganglionic indsprøjtning af RTX induceret uoprettelige tab af DRG neuroner22. Effekten af perifere RTX administration er dosisafhængig20,26,27, hvilket resulterede i forbigående desensibilisering eller degeneration af IENFs. Intriguingly, systematisk højdosis RTX behandling førte til neuropatisk smerte28, et symptom på lille fiber neuropati. Disse resultater tyder på, at behandling tilstand og dosis af RTX producere forskellige patologisk virkninger og neuronale reaktioner; nemlig perifere administration forhindret smerte transmission af lokale virkninger29 og påvirket af neuronal somata, der udviklede neuropatiske adfærd6. Kollektivt, viser disse resultater, at RTX har en multipotency effekt og rejste spørgsmålet, om der er en bestemt dosis af RTX, som systematisk kan påvirke de perifere nerver, såsom den perifere IENFs og centrale neuronal somata. I så fald kunne RTX være en potentiel agent til specifikt påvirker lille diameter neuroner og efterligne lille fiber neuropati i klinikken. For eksempel, er DM i klinikken et kompliceret spørgsmål, herunder stofskiftesygdom og neuropatologiske af perifere nerver, som er de vigtigste karakteristika ved lille fiber neuropati. Mekanismerne i DM-associerede lille fiber neuropati kunne ikke udelukke bidrag af stofskiftesygdom, der ikke muligvis er den vigtigste agent påvirker perifere nerver. DM-associerede lille fiber neuropati kræver derfor, en ren dyremodel, der kunne udelukke virkningerne af systematisk stofskiftesygdom. Denne protokol beskriver den arbejdende dosis af RTX at udvikle en typisk lille fiber neuropati model, herunder IENF degeneration og lille diameter neuron skade, som det fremgår af modificerede immunfarvning analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemical reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiniferatoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>avidin-biotin complex</td>
			<td>Vector</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antisera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripherin</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB-1527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGP9.5</td>
			<td>UltraClone</td>
			<td>RA95101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antisera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-075-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-095-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>IITC</td>
			<td>Model 39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Frey filament</td>
			<td>Somedic Sales AB</td>
			<td>10-600-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon coverplate</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>72110017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide rack</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>73310017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a mouse model of a pure small fiber neuropathy with the ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1

Patienter med diabetes mellitus (DM), eller dem, der oplever de neurotoksiske virkninger af kemoterapeutiske stoffer kan udvikle sensation lidelser på grund af degeneration og skade for lille diameter sensoriske neuroner, omtales som lille fiber neuropati. Nuværende dyremodeller for lille fiber neuropati påvirker både store - og lille diameter sensoriske fibre og dermed skabe en neuropatologiske alt for komplekse til korrekt vurdering af virkningerne af tilskadekomne lille diameter sensoriske fibre. Det er derfor nødvendigt at udvikle en eksperimentel model af ren lille fiber neuropati tilstrækkeligt undersøge disse spørgsmål. Denne protokol beskriver en eksperimentel model af lille fiber neuropati især berører lille diameter sensoriske nerver med resiniferatoxin (RTX), en ultrapotent agonist af forbigående receptor potentielle vanilloid type 1 (TRPV1), gennem en enkelt dosis intraperitoneal injektion, omtales som RTX neuropati. Denne RTX neuropati viste patologiske manifestationer og adfærdsmæssige abnormiteter, der efterligner de kliniske karakteristika for patienter med lille fiber neuropati, herunder intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specielt skade i lille diameter neuroner, og induktion af termiske hypoalgesia og mekanisk allodyni. Denne protokol testet tre doser af RTX (200, 50 og 10 µg/kg, henholdsvis) og konkluderede, at en kritisk dosis af RTX (50 µg/kg) er nødvendige for udviklingen af typiske lille fiber neuropati manifestationer, og forberedt en modificeret immunfarvning procedure til undersøge IENF degeneration og neuronal soma skade. Den ændrede procedure er hurtig, systematisk og økonomisk. Adfærdsmæssige evaluering af neuropatiske smerter er kritisk at afsløre funktionen af lille diameter sensoriske nerver. Evaluering af mekaniske tærskler i eksperimentel gnavere er særligt udfordrende og denne protokol beskriver en tilpasset metalnet, der er egnet til denne type af vurdering i gnavere. Sammenfattende er RTX neuropati en ny og let etablerede eksperimentel model til at vurdere den molekylære betydning og intervention underliggende neuropatiske smerter for udviklingen af terapeutiske agenter.

Denne protokol beskriver en roman musemodel af RTX neuropati, som specielt påvirker lille diameter neuroner, herunder IENF degeneration, forbundet med sensoriske forstyrrelser (figur 2). Efter den protokol, der er beskrevet heri, udstillede dyr termisk hypoalgesia og mekanisk allodyni på D7 post RTX injektion. At etablere denne lille fiber neuropati model, tre doser af RTX: 200, 50 og 10 µg/kg blev administreret af ruten i.p.. RTX dosis (50 µg/kg) blev an...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1 at JoVE.com

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Oprettelse af en musemodel af en ren lille Fiber neuropati med Ultrapotent Agonist af forbigående Receptor potentielle Vanilloid Type 1

Denne undersøgelse fastslår en eksperimentel model af ren lille fiber neuropati med resiniferatoxin (RTX). En unik dosis af RTX (50 µg/kg) er optimal til at udvikle en lille fiber neuropati model, der efterligner patient egenskaber og kan hjælpe med at undersøge de nociceptive molekylære betydning underliggende neuropatiske smerter.

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Parret Nanoinjection og Elektrofysiologi Assay til screening for bioaktivitet af forbindelser ved hjælp af Drosophila melanogaster Giant fibersystem

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin Digest protokol Analyser Retinal kar en musemodel

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

Visuelt fremkaldt Potentiel optagelse i en rotte model for Eksperimentel Optic Nerve Demyelinisering

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetics identifikation af en Neuronal Type med et glas Optrode i vågen mus

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Metoder til opdagelsen af nye forbindelser modulerende en Gamma - aminosmørsyre Receptor Skriv en Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinal transplantation af humant embryonalt stamcelleafledt nethindevæv i en kattemodel med store dyr

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...