Name: establishing a mouse model of a pure small fiber neuropathy with the ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1
Uploaded: 2018-02-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1 at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Medical University (KMU-M106028, KMU-S105034) och målet för topp universiteten beviljande (TP105PR15), Kaohsiung Medical University, Taiwan.

Alla de förfaranden som beskrivs är i enlighet med etiska riktlinjer för laboratorium djur30, och protokollet har godkänts av djur kommittén för Kaohsiung medicinska universitet, Kaohsiung, Taiwan.
1. inrättande av RTX neuropati
Varning: RTX är neurotoxiska och farliga. Vid kontakt och, fungerar det som en irriterande på ögon, slemhinnor och övre luftvägarna. Undvik inandning och bära lab glasögon och rockar under...

Effektiv behandling av små fiber neuropati i kliniken krävs för att främja funktionell återhämtning och livskvalitet för patienter. För närvarande finns det brist på en terapeutisk guide inriktning sensorisk störning är associerad med små fiber neuropati på grund av omfattande förståelse av de molekylära mekanismerna bakom liten diameter neuronal skada. Tidigare modeller av neuropati påverkas brukar både stor - och liten diameter sensoriska nerver; exempelvis modeller av kemoterapi-inducerad neuropati<...

Liten fiber neuropati som involverar neuropatisk smärta, vilket framgår av degeneration av IENFs, är vanligt i olika typer av villkor, såsom DM, och till följd av de neurotoxiska effekterna av kemoterapeutika1,2, 3,4,5. IENFs är de perifera terminalerna av liten diameter nervceller i de dorsala rotganglier (DRG), och påverkas parallellt i fall av IENF degeneration6. Exempelvis har förändrad uppströms genetisk transkription av neuronala somata visats av uppreglering av aktivera transkription faktorn-3 (ATF3)6,7. Utvärdering av IENFs innervation med hudbiopsi är dessutom användbar för diagnos av små fiber neuropati5,8,9. Traditionellt har profilerna för IENFs på hudbiopsi berodde på immunhistokemisk demonstration av protein genprodukten 9,5 (PGP 9,5)1,10,11. Sammantaget de patologiska profilerna av DRG och IENFs återspeglar den funktionella tillstånd underliggande små fiber neuropati och kan vara en indikator för de funktionella konsekvenserna av denna typ av neuropati på liten diameter neuroner.
Tidigare, flera experimentella modeller har behandlat frågan om IENF degeneration i fall av kemoterapi-inducerad neuropati12,13 och nerv skada orsakas av kompression eller transection14,15 , 16. dessa experimentella modeller påverkas också stor diameter nerver; Det var därför inte möjligt att utesluta bidrag till drabbade stor diameter nerverna i den observerade små fiber neuropati; exempelvis beror undersökningen av thermosensation störning av skadliga tillbakadragande på funktionella motoriska nervfibrer17,18,19. Således, om inrättande av en ren liten fiber neuropati modell och systematiskt undersöka patologiska status både neuronala somata och deras perifera kutan nervfibrer i liten diameter nervceller är nödvändigt och absolut nödvändigt.
RTX är ett capsaicin analoga och en potent agonist till transient receptor potential vanilloid receptor 1 (TRPV1), som medlar nociceptiva bearbetning20,21,22. Nyligen perifera RTX behandling lättad neurogen smärta23,24,25 och en intraganglionic injektion av RTX inducerad irreversibel förlust av DRG nervceller22. Effekten av perifera RTX administration är dosberoende20,26,27, vilket resulterade i övergående hyposensibilisering eller degeneration av IENFs. Spännande, systematisk högdos RTX behandling ledde till neuropatisk smärta28, ett symptom av små fiber neuropati. Dessa fynd tyder på att den behandling läge och dos av RTX producerar distinkta patologiska effekter och neuronala Svaren; nämligen perifer administrering förhindras smärta överföring av lokala effekter29 och påverkade de neuronala somata som utvecklat neuropatisk beteende6. Sammantaget visar dessa fynd att RTX har en multipotency effekt och tagit upp frågan huruvida det föreligger en viss dos av RTX som systematiskt kan påverka de perifera nerverna, som perifera IENFs och centrala neuronala somata. I så fall kanske RTX en potentiell agent att specifikt påverkar liten diameter nervceller och härma små fiber neuropati i kliniken. DM i kliniken är exempelvis en komplicerad fråga som inklusive ämnesomsättningssjukdom och neuropatologi av perifera nerver, som är de viktigaste egenskaperna av små fiber neuropati. Mekanismerna för DM-associerade små fiber neuropati kunde inte utesluta bidrag ämnesomsättningssjukdom som inte kanske är det huvudsakliga medlet påverkar perifera nerver. DM-associerade små fiber neuropati kräver därför en ren djurmodell som kunde utesluta effekterna av systematisk ämnesomsättningssjukdom. Det här protokollet beskriver den arbetande dosen av RTX att utveckla en typisk liten fiber neuropati modell, inklusive IENF degeneration och liten diameter neuron skada, vilket framgår av modifierade immunfärgning analys.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemical reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resiniferatoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>avidin-biotin complex</td>
			<td>Vector</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antisera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripherin</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB-1527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGP9.5</td>
			<td>UltraClone</td>
			<td>RA95101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antisera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-075-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-095-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>IITC</td>
			<td>Model 39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Frey filament</td>
			<td>Somedic Sales AB</td>
			<td>10-600-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon coverplate</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>72110017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide rack</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>73310017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a mouse model of a pure small fiber neuropathy with the ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1

Patienter med diabetes mellitus (DM) eller dem som upplever de neurotoxiska effekterna av kemoterapeutiska medel kan utveckla sensation störningar på grund av degeneration och skada av liten diameter sensoriska nervceller, som små fiber neuropati. Närvarande djurmodeller av små fiber neuropati påverkar både stor - och liten diameter sensoriska fibrer och därmed skapa en neuropatologi alltför komplex för att korrekt bedöma effekterna av skadade liten diameter sensoriska fibrer. Det är därför nödvändigt att utveckla en experimentell modell av ren liten fiber neuropati på lämpligt sätt undersöka dessa frågor. Det här protokollet beskriver en experimentell modell av små fiber neuropati som specifikt påverkar liten diameter sensoriska nerver med resiniferatoxin (RTX), en ultrapotent agonist av transient receptor potential vanilloid typ 1 (TRPV1), genom en engångsdos av intraperitoneal injektion, kallad RTX neuropati. Detta RTX neuropati visade patologiska manifestationer och beteendemässiga avvikelser som efterliknar de kliniska kännetecken för patienter med små fiber neuropati, inklusive intraepidermal nerv fiber (IENF) degeneration, särskilt skada i liten diameter nervceller, och induktion av termiska hypoalgesia och mekanisk allodyni. Detta protokoll testade tre doser av RTX (200, 50 och 10 µg/kg, respektive) och drog slutsatsen att en kritisk dos av RTX (50 µg/kg) krävs för utveckling av typiska små fiber neuropati manifestationer och förberett en modifierad immunfärgning förfarande för att undersöka IENF degeneration och neuronala soma skada. Det modifierade förfarandet är snabb, systematisk och ekonomiska. Beteendemässiga utvärdering av neuropatisk smärta är kritiska att avslöja funktionen av liten diameter sensoriska nerver. Utvärdering av mekaniska trösklar i experimentell gnagare är särskilt utmanande och det här protokollet beskriver en anpassad metallnät som är lämplig för denna typ av bedömning hos gnagare. Sammanfattningsvis är RTX neuropati en enkelt etablerade och nya experimentella modell att utvärdera molekylär betydelse och ingripande underliggande neuropatisk smärta för utveckling av terapeutiska medel.

Det här protokollet beskriver en ny musmodell av RTX neuropati, som specifikt påverkar liten diameter nervceller, inklusive IENF degeneration, associerade med sensoriska störningar (figur 2). Efter protokollet beskrivs häri, utställda djur termisk hypoalgesia och mekanisk allodyni på D7 efter RTX injektionen. Att upprätta denna små fiber neuropati modell, tre doser av RTX: 200, 50 och 10 µg/kg administrerades av i.p. rutten. RTX dosen (50 µg/kg) ans...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1 at JoVE.com

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Om inrättande av en musmodell av en ren liten Fiber neuropati med den Ultrapotent Agonist av Transient Receptor Potential Vanilloid typ 1

Denna studie upprättar en experimentell modell av ren liten fiber neuropati med resiniferatoxin (RTX). En unik dos av RTX (50 µg/kg) är optimal för att utveckla en liten fiber neuropati modell som härmar patientens egenskaper och kan hjälpa till att undersöka nociceptiva molekylär betydelsen bakom neuropatisk smärta.

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Tillämpning av en NMDA-receptorn Konduktans av dopaminerg Rat mitthjärnan Nervceller med det dynamiska Clamp Teknik

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Etablera Embryonala Mus Neurala Kultur Stem Cell Använda Neurosphere analys

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Hela berget Beredning av vuxna Drosophila På magen Nerve Snodd till Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Kopplade Nanoinjection och elektrofysiologi analys för att undersöka Bioaktivitet hos föreningar med hjälp av Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin Digest protokollet för att analysera den Retinal kärlsystemet av en musmodell

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

Visual evoked potential inspelning i en råttmodell av experimentell Optic Nerve Demyelinisering

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetik identifiering av en Neuronal typ med ett glas Optrode i vaken möss

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Metoder för upptäckten av nya föreningar modulera en Gamma - aminosmörsyra Receptor typ en Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinal transplantation av mänsklig embryonal stamcellsderiverad näthinnevävnad i en kattmodell för stora djur

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...