Name: auditory brainstem response and outer hair cell whole-cell patch clamp recording in postnatal rats
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem 973 Programm (2014CB943002) und die National Natural Science Foundation of China (11534013, 31500841) unterstützt.

Alle experimentelle Protokolle mit tierischen Probanden stimmten mit der Tier-Ethik-Kommission der Southern Medical University.
1. bereiten Sie Lösungen für Experimente
<ol><li>Vorbereiten die Narkose (siehe Tabelle der Materialien): 1,5 % Pentobarbital-Natrium aufgelöst in DdH2O.</li>
	<li>Bereiten Sie die Dissektion-Lösung (siehe Tabelle der Materialien): ein Beutel Leibovizs L-15 Pulver in 1 L des DdH2O. Adjust pH-Wert 7.3 mit 1 ...

<ol>
	<li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell:+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout.">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li><li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+amplification,+outer+hair+cells+and+prestin.">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse.">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li><li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells.">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li><li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex.">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).</li><li>De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+(A1)+in+the+rat.">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li><li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells.">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li><li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats.">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826 (2016).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+(Mus+musculus).">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li><li>M&#248;ller, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).</li><li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells.">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li><li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Pendrin+Protein,+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor.">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells.">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li></ol>

Bei Ratten jünger als 11. Tag konnte kein Aktionspotential in Reaktion auf klangstimulation im auditorischen Kortex6,7beobachtet werden. Daher bezeichnet man als "Anhörung Ausbruch"10postnatale Tag 11. Die Entwicklung des Gehörs vor Beginn der mündlichen Verhandlung noch nicht gut untersucht wurde. Ähnliche Methode für Erwachsene ABR Aufnahme, wir zeigen, dass ABRs durch reinen Ton Burst Ratte Welpen jünger als P11 ausgelöst werden...

Zwei unterschiedliche Funktionen von Cochlea-sensorischen Haarzellen sind für Säugetiere hören: Mechanoelectric Transduktion (MET) und Electromotility1,2. Durch MET-Kanäle in das Haarbündel, IHC (IHC) und OHCs konvertieren Klangschwingung Membran potenzielle Veränderungen sowie die elektrischen Signale der innervierten Spirale Ganglion Neuronen gelegen. OHCs ihre Zelle Länge mit dem Membranpotential ändern und die Schwingung des Low-Level-Sound zu verstärken. Diese Tätigkeit als Electromotility bezeichnet wird durch den motor Protein Prestin befindet sich in der Seitenwand des OHCs3abgeleitet.
In vielen Arten, einschließlich der Nagetiere ist die Anhörung Funktion unreif in frühen postnatalen Epoche4,5. Kein Aktionspotential in Reaktion auf akustische Signale konnte im auditorischen Kortex vor der mündlichen Verhandlung Anfang6,7nachgewiesen werden. Entwicklung der Morphologie und Funktion der Cochlea ist weit verbreitet in Maus, Rennmaus und Ratte4,5,8untersucht worden. Der mechanotransduktion und Electromotility der Haarzellen entstehen auch in den frühen Leben Epoche5.
Um die Hörfähigkeit Empfindlichkeit von Ratten in verschiedenen Altersstufen postnatale zu bewerten, haben wir eine Methode für auditory Brainstem Response (ABR) Aufnahme in Ratte Welpen entwickelt. Ganze Zelle Patch-Clamp ist eine ideale Technologie um die OHCs Elektrophysiologisch untersuchen. Allerdings begrenzt die niedrige Rate der gesamten Zelle Versiegelung im Vergleich mit der Patch-Clamp in Neuronen und anderen epithelialen Zellen durchgeführt, die Untersuchung der Electromotility der isolierten OHCs.
Hier beschreiben wir ein Verfahren um die OHCs morphologisch und Elektrophysiologisch in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Diese Methode kann geändert werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die inneren Haarzellen Entwicklung und Funktion regulieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td>1.5% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leiboviz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41300-039</td>
			<td>1 pack in 1 L water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/mL in L-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PH 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>ZS-0694</td>
			<td>0.3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10000C</td>
			<td>10% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>prestin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-22694</td>
			<td>dil 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>dil 1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>dil 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C0060</td>
			<td>dil 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leiboviz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41300-039</td>
			<td>1 pack in 1 L water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-17-8</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-42-5</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td>OSMOMAT 3000 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14095</td>
			<td>Tweezers dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MODLE-P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>Narishigen</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Operating System</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp</td>
			<td>Axon</td>
			<td>700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES1 speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDT system 3</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigGenRP software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSigRP software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jClamp</td>
			<td>Scientific Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD rat</td>
			<td>Experimental Animal Center of Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

auditory brainstem response and outer hair cell whole-cell patch clamp recording in postnatal rats

Die äußeren Haarzellen ist eines der zwei Arten von sensorischen Haarzellen in der Säugetier-Cochlea. Sie verändern ihre Zelle Länge mit dem Rezeptor potential um die schwache Vibration der Low-Level-akustisches Signal zu verstärken. Die Morphologie und elektrophysiologische Eigentum der äußeren Haarzellen (OHCs) im frühen postnatalen Alter zu entwickeln. Die Reifung der äußeren Haarzellen kann zur Entwicklung des auditorischen Systems. OHCs Entwicklungsprozess ist jedoch nicht gut untersucht. Dies ist zum Teil wegen der Schwierigkeit, ihre Funktion an eine elektrophysiologische Ansatz zu messen. Mit dem Ziel der Entwicklung einer einfachen Methode zur Lösung des obigen Problems, beschreiben wir hier eine Schritt für Schritt Protokoll, um die Funktion des OHCs in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Mit dieser Methode können wir bewerten die Cochlea-Reaktion auf reinen Ton Reize und untersuchen die Ausdruck Ebene und die Funktion der motorischen Protein Prestin in OHCs. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die inneren Haarzellen (IHC) zu untersuchen.

ABR kann von narkotisierten Ratte Welpen älter als postnatale 7.Tag (P7) mit reinen Ton platzt (Abbildung 1A) hervorgerufen werden. Wie in Abbildung 1 bgezeigt, erhielt die ABR-Wellenformen von Ratte Welpen zeigte nur drei bis vier unterschiedliche Wellen mit kleiner Amplitude. In der Regel bis zu sieben Gipfel in ABR Wellenformen adulter Tiere (Abbildung 1 b) beobachtet.
<p class="jove_content"...

Watch this Scientific Journal Video about Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats at JoVE.com

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats (Video) | JoVE

Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um die auditory Brainstem Antwort vom postnatalen Ratte Welpen aufnehmen. Um die funktionelle Entwicklung des äußeren Haarzellen zu untersuchen, ist das experimentelle Verfahren der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme in isolierten äußeren Haarzellen Schritt für Schritt beschrieben.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

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Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forschung

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Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

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GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

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Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

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Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

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