Name: auditory brainstem response and outer hair cell whole-cell patch clamp recording in postnatal rats
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa 973 (2014CB943002) e o Nacional Natural Science Foundation da China (11534013, 31500841).

Todos os protocolos experimentais envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da universidade médica do Sul.
1. prepare soluções para experimentos
<ol><li>Preparar o anestésico (ver Tabela de materiais): 1.5% pentobarbital de sódio dissolvido em ddH2O.</li>
	<li>Preparar a solução de dissecação (ver Tabela de materiais): dissolver um saco de pó de L-15 do Leiboviz em 1 L de DDQ2O. ajuste de pH par...

<ol>
	<li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell:+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout.">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li><li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+amplification,+outer+hair+cells+and+prestin.">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse.">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li><li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells.">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li><li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex.">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).</li><li>De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+(A1)+in+the+rat.">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li><li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells.">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li><li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats.">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826 (2016).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+(Mus+musculus).">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li><li>M&#248;ller, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).</li><li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells.">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li><li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Pendrin+Protein,+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor.">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells.">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li></ol>

Em ratos mais jovens do que de dia 11, sem potencial de ação em resposta à estimulação sonora pode ser observada no córtex auditivo6,7. Portanto, dia pós-natal 11 é descrito como "início de audiência"10. O desenvolvimento da função auditiva antes de início da audiência não foi bem estudado ainda. Usando o método semelhante para a gravação de ABR adulta, demonstramos que ABRs poderiam ser provocados pela explosão de Tom p...

Duas funções distintas coclear células sensoriais são essenciais para a audição dos mamíferos: transdução de mechanoelectric (MET) e electromotility1,2. Por canais MET localizados no pacote o cabelo, IHCs (IHCs) e OHCs converter som vibração em alterações do potencial de membrana, bem como os sinais elétricos dos neurônios do gânglio espiral inervado. OHCs alterar seu comprimento de células com o potencial de membrana e amplificam a vibração do som de baixo nível. Essa atividade denominada electromotility é derivada pelo motor proteína prestin localizado na parede lateral do OHCs3.
Em muitas espécies, incluindo roedores, a função auditiva é imatura na época início pós-natal4,5. Sem potencial de ação em resposta a sinais sonoros pode ser detectado no córtex auditivo antes do início de audiência6,7. Desenvolvimento da morfologia e função da cóclea tem sido amplamente estudadas em rato, rato e rato4,5,8. O mechanotransduction e electromotility de células ciliadas são também desenvolvidos no início da época de vida5.
A fim de avaliar a sensibilidade auditiva de ratos em diferentes idades pós-natal, nós desenvolvemos um método para auditivo de tronco encefálico (ABR) gravação em filhotes. Braçadeira do remendo de célula inteira é uma tecnologia ideal para investigar os OHCs electrophysiologically. No entanto, em comparação com a braçadeira do remendo realizada em neurônios e outras células epiteliais, a baixa taxa de selagem da célula inteira limitado a investigação de electromotility de OHCs isoladas.
Aqui descrevemos um procedimento para investigar os OHCs morfologicamente e electrophysiologically na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Esse método pode ser modificado para estudar os mecanismos moleculares que regulam a função e desenvolvimento celular interna do cabelo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td>1.5% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leiboviz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41300-039</td>
			<td>1 pack in 1 L water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/mL in L-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PH 7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>ZS-0694</td>
			<td>0.3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10000C</td>
			<td>10% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>prestin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-22694</td>
			<td>dil 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>dil 1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>dil 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C0060</td>
			<td>dil 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leiboviz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41300-039</td>
			<td>1 pack in 1 L water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-17-8</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-42-5</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td>OSMOMAT 3000 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14095</td>
			<td>Tweezers dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MODLE-P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>Narishigen</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Operating System</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp</td>
			<td>Axon</td>
			<td>700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Noise Data Acquisition System</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES1 speaker</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDT system 3</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigGenRP software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSigRP software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jClamp</td>
			<td>Scientific Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD rat</td>
			<td>Experimental Animal Center of Southern Medical University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

auditory brainstem response and outer hair cell whole-cell patch clamp recording in postnatal rats

A célula externa do cabelo é um dos dois tipos de células sensoriais ciliadas da cóclea mamíferos. Eles alteram seu comprimento de células com o receptor do potencial para amplificar a vibração fraca do sinal de som de baixo nível. A morfologia e a propriedade eletrofisiológica de células ciliadas exteriores (OHCs) desenvolvem na idade pós-natal. A maturação da célula exterior de cabelo pode contribuir para o desenvolvimento do sistema auditivo. No entanto, o processo de desenvolvimento de OHCs não é bem estudado. Isto é parcialmente devido à dificuldade de medir sua função por uma abordagem eletrofisiológica. Com o objetivo de desenvolver um método simples para resolver o problema acima, aqui descrevemos um protocolo passo a passo para estudar a função do OHCs na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Com este método, podemos avaliar a resposta coclear aos estímulos de Tom puro e examinar o nível de expressão e a função da proteína motor prestin em OHCs. Esse método também pode ser usado para investigar as células ciliadas interiores (IHCs).

ABR pode ser provocada de anestesiados filhotes mais velhos que o 7º dia pós-natal (P7) usando rajadas de Tom puro (figura 1A). Como mostrado na figura 1B, as formas de onda ABR obtidas de filhotes mostrou apenas três ou quatro ondas distintas com pequena amplitude. Normalmente, até sete picos foram observadas as formas de onda ABR de animais adultos (figura 1B).
<p class="jove_content" fo:ke...

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Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Neurociência

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cirurgia de implante coclear e gravações de resposta eletricamente evocado auditivo do tronco encefálico em camundongos C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

Avaliação da Resposta Auditiva do Brainstem em Filhotes de Frango

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...