Name: transient expression of foreign genes in insect cells (sf9) for protein functional assay
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay at JoVE.com

אנו מודים Leu ג'יאן-Horng ד ר של המכון של ביולוגיה ימית, האוניברסיטה הלאומית טייוואן האוקיינוס על מתן 3 מבנים פלסמיד. מחקר זה נתמך על ידי מענק 106-2311-B-197-001 - משרד המדע, הטכנולוגיה (רובם).

1. תכשירים
<ol><li>תרבית תאים חרקים<ol>
<li>להכין 50 מ של התא תרבות בינוני. כדי לבצע זאת, הוסף µL 500 של אנטיביוטיקה (המפוטריצין = 0.25 µg/mL, פניצילין = 100 יחידות/mL, סטרפטומיצין = 100 µg/mL) ו 5 מ של חום-לא פעיל העובר שור סרום ללא סרום תא בינוני תרבות (ללא FBS או אנטיביוטיקה). הערה: מחממים את הנסיוב שור עוב...

<ol>
	<li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculoviruses+as+gene+expression+vectors.">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li><li>Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family+Baculoviridae.">Family Baculoviridae.</a> Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).</li><li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleopolyhedrovirus'+taxonomic+position.">Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position.</a> Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).</li><li>Friesen, P. D., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+baculovirus+early+gene+expression.">Regulation of baculovirus early gene expression.</a> The Baculoviruses. , 141-170 (1997).</li><li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li><li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+development+of+baculovirus+expression+vectors.">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li><li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors.">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li><li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap.">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li><li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+(IAP)+from+the+tiger+shrimp,+Penaeus+monodon.">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li><li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells.">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li><li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculoviral+IAP2+and+IAP3+encoded+by+Lymantria+xylina+multiple+nucleopolyhedrovirus+(LyxyMNPV)+suppress+insect+cell+apoptosis+in+a+transient+expression+assay.">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017)</li><li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+(IAPs).">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li></ol>

המושג חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת תוארה לראשונה על ידי קלם. et al. ב 19948. השוואה של יזם ג'ין baculoviral (IE1) ודרוזופילה hsp70 הראו שכי hsp70 היה יעילות גבוהה יותר של יתוש תאים10. יתר על כן, כתוצאה אינדוקציה הלם חום, העיתוי של ביטוי חלבון יכול להיות נשלט בד?...

שתי מערכות ביטוי חלבון נפוץ השתמשו לייצור חלבונים: פרוקריוטים חלבון ביטוי (Escherichia coli ג'ין ביטוי מערכת) ומערכות איקריוטים חלבון הביטוי. מערכת אחת של ביטוי חלבון איקריוטים הפופולרי הוא מערכת (BEVS)1וקטור ביטוי baculovirus. Baculoviruses שימשו כסוכנים הדברה ביולוגית ברחבי העולם החקלאיים ואת יער מזיקים. בעשורים האחרונים, baculoviruses פותחו ככלים ביוטכנולוגי וקטורים ביטוי חלבון גם כן. הגנום של baculoviruses מורכב כפול גדילי DNA מעגלי ומעטפת nucleocapsids2. עד היום, יותר מאשר seventy-eight baculovirus היה מבודד ברצף3. בהתבסס על המפל הטמפורלי של ביטויים ג'ין baculoviral בתאי חרקים המארח, שעתוק הגן ניתן לסווג ארבעה מפלי הזמנית, כולל מיידית מוקדם, מוקדם-נדחתה, מאוחר, מאוחר מאוד גנים4.
BEVSs נקבעו כך היזמים הגן באיחור (כלומר, פאון או p10 יזם) שימשו כדי להסיע את הגנים היעד, בזמן baculovirus רקומביננטי נוצר על ידי רקומבינציה הומולוגית. ביטוי של חלבונים זרים בתאי חרקים על-ידי baculovirus רקומביננטי דומה לזה של חלבונים בתרבית של שינויים post-translational (מתאים לייצור גליקופרוטאין). לפיכך, baculovirus כבר בשימוש נרחב5,6,7. עם זאת, מגבלה אחת היא הנוכחות של מסלולים שונים N-גליקוזילציה ב תאים חרקים7.
לכן, baculovirus ביטוי מערכת חדשה, מערכת ביטוי גנים ארעי, פותחה. מערכת זו מבטא גנים זרים תחת הכונן של היזמים מוקדם-מיידי baculoviral (כלומר-1 יזם) בתאי חרקים. באמצעות מערכת זו, חלבון המטרה ניתן מיד לבטא תחת השליטה של ie-1 יזם תוך שינוי מסלול N-גליקוזילציה בתאי חרקים, וכתוצאה מכך oligosaccharides N-מקושרים יותר7. יתר על כן, הגנים מוקדם-מיידי baculoviral משוקלטים על-ידי התא המארח RNA פולימראז II, אינם דורשים כל גורם ויראלי עבור הפעלה4. לכן, חלבונים זרים יכולים להתבטא בתאי חרקים תוך זמן קצר. עד כה, והחולף מערכת ביטוי גנים הוא אחד הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע מבחני פונקציונלי חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות. ניתן להחיל את המערכת כדי לנתח את הפונקציה של baculovirus או חלבונים זרים. אחת ממערכות ביטוי גנים ארעי זמינים מסחרית מבוסס על היזמים מוקדם-מיידי ג'ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2, OpIE1 היזמים).
עם זאת, הרמה הנמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים היה עדיין בעיה כאשר המערכת הביטוי מבוסס-יזם ג'ין ארעי אופי הייתה בשימוש8,9,10. לפיכך, מערכת נוספת של ביטוי גנים ארעי נבנה בהתבסס על האמרגן של דרוזופילה חום הלם חלבון 70 (hsp70) ג'ין8,9. האמרגן של hsp70 עובד ביעילות רבה יותר מאשר יזם baculoviral IE כאשר המושרה על ידי הלם חום בתאי חרקים10. במערכת זו, הגנים היעד שבאו לידי ביטוי תחת הכונן של דרוזופילה הלם חום (Dhsp70) 70 יזם. גנים זרים יכולים להיות בקלות משובטים לתוך פלסמיד ביטוי גנים ארעי על ידי שיטות שיבוט מבוסס ה-PCR. יתר על כן, השליטה של התזמון של ביטוי גנים יכול להתבצע על ידי אינדוקציה הלם חום.
בדו ח זה, אנו בצע את הגישה ולבטא את שלוש truncations שונים של הגן baculoviral (מעכב של אפופטוזיס 3, iap3 מן Lymantria xylina MNPV) באמצעות מערכת ביטוי חלבון ארעי מבוסס-הלם חום, ביטוי חלבונים אלה יחולו על ניתוח פעילות אנטי-מוות. מערכת זו יכול לבטא גם חלבונים זרים במהירות או יותר להחיל על הערכת פעילות אנטי-מוות החלבון בתאים sf9, בעודכם נהנים גם את הפוטנציאל שיוחל מבחני פעילות חלבונים אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>for insect cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Bioind</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 II SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10902096</td>
			<td>serum-free cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 cell culture flask</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscopy</td>
			<td>WHITED</td>
			<td>WHITED WI-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC HIT Competent Cell</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>RH618-J80</td>
			<td>Escherichia coli (DH5&#945;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L.B. Broth (Miller)</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>LBL407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Bacteriological Grade</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>AGR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>selection antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>PIE25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Gizmo Supply Co</td>
			<td>B-CNT-SLDE-V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Multidish</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>142475</td>
			<td>24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10362100</td>
			<td>cell transfectin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215;SDS Loading Dye</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>PVDF membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell system</td>
			<td>BIO-RED</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Blotting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>6226-79-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-V5</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>V8137</td>
			<td>rabbit anti-V5 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>817072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Multidish</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>145380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 % trypan blue solution</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Symbio</td>
			<td>PPS7</td>
			<td>24 well tape ( 19 mm&#215;36 M)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of foreign genes in insect cells (sf9) for protein functional assay

אחת הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע אנליזה פונקציונלית חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות מערכת ביטוי גנים ארעית. מערכת זו פותחה כדי גנים זרים אקספרס תחת השליטה של האמרגן baculoviral ב ביטוי ארעי פלסמידים. יתר על כן, מערכת זו ניתן להחיל על assay פונקציונלי של baculovirus עצמו או חלבונים זרים. מערכת ביטוי נרחב ביותר מבחינה מסחרית זמינים ג'ין ארעי מפותח בהתבסס על האמרגן מוקדם-מיידי ג'ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). עם זאת, נצפתה רמה נמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים. לכן, מערכת ביטוי גנים ארעי נבנה לשיפור ביטוי חלבון. במערכת זו, פלסמידים רקומביננטי נבנו כדי להכיל את רצף המטרה תחת השליטה של דרוזופילה חום הלם 70 (Dhsp70) האמרגן. פרוטוקול זה מציג את היישום של זה חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו (V5 epitope עם היסטידין 6) /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9); מערכת זו זמינה רק עבור ביטוי גנים אלא גם להערכת פעילות אנטי-מוות של המועמד חלבונים בתאי חרקים. יתר על כן, מערכת זו יכולים להיות transfected שגם עם פלסמיד רקומביננטי אחד או transfected משותפת לשני פלסמידים רקומביננטי אויבת פוטנציאלית פונקציונלית בתאי חרקים. הפרוטוקול מדגים את היעילות של מערכת זו ומספק במקרה המעשי של טכניקה זו.

אורך מלא, אחרים truncations שני (ביר וטבעת תחומים) של Ly-IAP3 מ- LyxyMNPV היו overexpressed בתאים sf9, בהתבסס על החום מבוסס-הלם pDHsp/V5-שלו /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9). PDHsp/V5-שלו הכיל דרוזופילה חום הלם חלבון מקדם מכירות, אשר כוננים ביטוי גנים במורד הזרם בטמפרטורה של 42 ° C בתנאי באמצעות...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay at JoVE.com

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

The overall goal of this heat shock-induced protein expression system is to evaluate protein anti-apoptotic activity in two potentially functionally antagonistic proteins in insect cells. This method can help answer key questions about the functions and activities of candidate proteins in biotechnology and proteomics, such as their anti-apoptotic activities and protein interactions. The main advantage of this technique is that the timing of gene expression is controlled by heat shock induction.So this method can provide insight into protein functional status. It can also be applied to other systems, such as mammalian protein expression. The Spodoptera frugiperda, or Sf9, insect cells used in this protocol are grown in cell culture medium in 25 square centimeter cell culture flasks at 28 degrees Celsius.Shake the cell culture flask to detach the cells from the flask. Then check under a light microscope to make sure that about 80%of the cells are detached. Transfer 50%of the cell suspension to a new 25 square centimeter cell culture flask, and allow the cells to attach at room temperature for 15 minutes.After 15 minutes, replace the medium with five milliliters of fresh culture medium, and grow in an incubator at 28 degrees Celsius. Depending on the cell growth, passage the cells every two to three days. Prior to harvesting the Sf9 cells, it is important to check the cells under the light microscope to make sure that there is no contamination by bacteria or other microorganisms.To harvest the Sf9 cells, shake the culture flask to detach the cells, and then transfer the cell suspension to a 15-milliliter tube. Using a P10 pipette, transfer 10 microliters of the cell suspension to a hemacytometer, and count the cell number under the light microscope. Plate three times 10 to the fifth cells into each well of a 24-well plate, and leave at room temperature for 15 minutes.After 15 minutes, replace the medium with 0.5 milliliters of plating medium. Prepare the cell transfection regent. For each transfection, dilute eight microliters of cell transfection reagent with 100 microliters of serum-free cell culture medium, and vortex for one second to mix.In this study, three different truncations of the baculoviral gene, inhibitor of apoptosis 3, or IAP3, will be expressed under the control of the Drosophila heat shock 70 promoter, the full-length IAP3, a truncation lacking the RING domain, and a truncation lacking the BIR domain. Add two micrograms of each plasmid DNA into 100 microliters of serum-free cell culture medium, and mix by vortexing for one second. Prepare a positive control as well.Combine the diluted plasmid DNA and diluted cell transfection reagent, and mix by vortexing. Incubate at room temperature for 30 minutes. Using a P1000 pipette, add 210 microliters of each DNA transfection reagent mixture dropwise onto the cells.Incubate at 28 degrees Celsius for five hours. After five hours, replace the plating medium with 0.5 milliliters of cell culture medium, and then seal the 24-well plate with tape. Incubate at 28 degrees.On the following day, heat shock to induce protein expression by floating the plate in a 42 degree Celsius water bath for 30 minutes. After 30 minutes, return the 24-well plate to the 28 degree Celsius incubator. Protein expression is subsequently confirmed by Western blot as described in the text protocol.To examine gene-induced cell apoptosis, first prepare Sf9 cells as demonstrated earlier. Next, transfect the cells in the same manner as before, but include one microgram of a plasmid containing an apoptosis inducer gene in each transfection reaction. Incubate at 28 degrees Celsius for five hours, replace the medium, and incubate for 16 hours.Heat shock the transfected cells at 42 degrees Celsius for 30 minutes. Incubate the cells at 28 degrees Celsius for five hours before conducting the cell viability assay. For chemical-induced cell apoptosis, plate one times 10 to the six Sf9 cells into each well of a six-well plate.Leave at room temperature for 15 minutes, and then replace the medium with one milliliter of plating medium. Transfect the cells with four micrograms of each plasmid DNA. After five hours, replace the plating medium with one milliliter of cell culture medium, and incubate the cells at 28 degrees Celsius for 16 hours.Then heat shock at 42 degrees Celsius for 30 minutes. Incubate the cells at 28 degrees Celsius for five hours post-heat shock. Then treat the transfected cells with actinomycin D to induce apoptosis.Incubate at 28 degrees Celsius for 16 hours before conducting the cell viability assay. Begin this procedure by washing the treated cells. Remove the medium from each well, add one milliliter of PBS, and leave for one minute.Wash the cells three times with PBS in this manner. Resuspend the cells in each well with one milliliter of PBS containing 04%trypan blue, and stain at room temperature for three minutes. Transfer the cell suspension into a 1.5 milliliter microfuge tube.Transfer 10 microliters of the trypan blue-stained cell suspension to a hemacytometer, and count the viable intact cells under a light microscope. Finally, perform statistical analysis as described in the text protocol. The full length and two truncations of IAP3 from Lymantria xylina MNPV were overexpressed in Sf9 cells, and Western blot was performed on cell lysates to confirm protein expression.The anti-apoptotic protein Ac-P35 was included as a positive control. All proteins could be detected in transfected cells at either one hour or five hours post-heat shock, with a higher expression at five hours. This system can be adapted to evaluate anti-apoptotic activity.For gene-induced cell apoptosis, the apoptosis inducer Drosophila Reaper was co-transfected with target gene plasmid constructs into Sf9 cells, which were subsequently heat shocked to activate gene expression. Compared to the vector Drosophila Reaper, the positive control showed high anti-apoptotic activity, reaching up to 80%of the viability rate. The other constructs showed various effects on anti-apoptotic activity.For chemical-induced cell apoptosis, only one construct was transfected into Sf9 cells, and actinomycin D was added five hours post-heat shock. Compared to the positive control or the negative control, the other constructs showed various effects on anti-apoptotic activity. Once mastered, this technique can be done in two to three days if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to remember to obey the operation rules of cell culture in laminar flow and check the status of cells diligently. Following this procedure, other methods, such as co-immunoprecipitation, can be performed to answer additional questions, like whether there is any interaction between the two proteins co-expressed in the insect cells. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of biotechnology to explore protein functions in animal or microorganisms.After watching this video, you should have a good understanding of how to use this system to express foreign protein or evaluate potentially functionally antagonistic proteins in insect cells. Don't forget that working with some chemicals, like actinomycin D, can be extremely hazardous, and precautions, such as wearing gloves, should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

שמירה על תרבויות ביולוגי מדידה ביטוי גנים ב Aphis nerii: מערכת Non-מודל עבור אינטראקציות צמח-חרק

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...