Name: transient expression of foreign genes in insect cells (sf9) for protein functional assay
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay at JoVE.com

Мы благодарим д-ре Лое Цзянь-Horng институт морской биологии, Национальный университет Тайваня океана для предоставления 3 плазмидные конструкции. Это исследование было поддержано на грант 106-2311-B-197-001 - от министерства науки и технологии (большинство).

1. Подготовка
<ol><li>Культура клеток насекомых<ol>
<li>Подготовка 50 мл среды культуры клеток. Чтобы сделать это, добавьте 500 мкл антибиотиков (амфотерицин B = 0,25 мкг/мл, пенициллин = 100 единицы/мл, стрептомицина = 100 мкг/мл) и 5 мл сыворотки тепла инактивированная плода говядину в среде культуры кл?...

<ol>
	<li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculoviruses+as+gene+expression+vectors.">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li><li>Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family+Baculoviridae.">Family Baculoviridae.</a> Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).</li><li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleopolyhedrovirus'+taxonomic+position.">Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position.</a> Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).</li><li>Friesen, P. D., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+baculovirus+early+gene+expression.">Regulation of baculovirus early gene expression.</a> The Baculoviruses. , 141-170 (1997).</li><li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li><li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+development+of+baculovirus+expression+vectors.">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li><li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors.">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li><li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap.">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li><li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+(IAP)+from+the+tiger+shrimp,+Penaeus+monodon.">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li><li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells.">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li><li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculoviral+IAP2+and+IAP3+encoded+by+Lymantria+xylina+multiple+nucleopolyhedrovirus+(LyxyMNPV)+suppress+insect+cell+apoptosis+in+a+transient+expression+assay.">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017)</li><li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+(IAPs).">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li></ol>

Концепция системы тепла на основе шок клеток pDHsp/V5-его/sf9 был впервые описан Клем et al. 19948. Сравнение baculoviral гена промоутер (IE1) и дрозофилы hsp70 показали, что что hsp70 имели более высокую эффективность в клетках комаров10. Кроме того из-за тепловой ш?...

Две системах выражения протеина широко использовались для производства белков: системах выражения протеина прокариот (кишечная палочка ген выражение системы) и эукариоты системах выражения протеина. Один из популярных эукариоты системе выражения протеина является бакуловирусы выражение вектор системы (BEVS)1. Baculoviruses впервые были использованы как во всем мире биоконтролирующих агентов сельскохозяйственных и лесных вредителей. В последние несколько десятилетий как биотехнологические инструменты для векторов выражения протеина также были разработаны baculoviruses. Геномы baculoviruses состоят из круговой двуцепочечной ДНК и запечатанная nucleocapsids2. На сегодняшний день, более чем семьдесят бакуловирусы изолятов были виртуализированного3. На основании временной Каскад выражения гена baculoviral в клетки хозяина насекомых, транскрипции гена могут быть разделены на четыре временных каскады, включая немедленное ранний, задержка начале, конце и очень поздно гены4.
BEVSs были определены таким образом, что очень поздно генным стимуляторам (то есть, многогранник или p10 промоутер) были использованы для привода целевых генов, в то время как рекомбинантной бакуловирусы была порождена гомологичная рекомбинация. Выражение иностранных белков в клетках насекомых, рекомбинантных бакуловирусы похож на млекопитающих белков в столб-поступательные изменения (подходит для производства гликопротеин). Таким образом бакуловирусы был широко используется5,6,7. Однако одно ограничение является наличие различных путей N-гликозилирования насекомых клетки7.
Таким образом была разработана новая система бакуловирусы выражение, выражение системы переходных гена. Эта система выражает чужеродные гены под диск baculoviral немедленного начале промоутеров (ie-1 промоутер) в клетках насекомых. С помощью этой системы, целевого белка может быть сразу же выражена под контролем промотора ie-1 во время изменения N-гликозилирования путь в клетках насекомых, что приводит к лучшей олигосахариды, связанный с N7. Кроме того baculoviral немедленно ранняя гены транскрибируются РНК полимеразой II клетки-хозяина и не требуют какой-либо вирусной фактор для активации4. Таким образом иностранные белков может быть выражено в клетках насекомых в течение короткого времени. На сегодняшний день, переходные системы выражения гена является одним из наиболее важных технологий для выполнения функциональных анализов белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Система может применяться для анализа функции бакуловирусы или инородные белки. Один из коммерчески доступных временных ген выражение систем основана на промоутеров немедленного начала гена (IE) Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 и OpIE1 промоутеров).
Однако ниже уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых еще была проблема, когда система выражение на основе промоутер переходных гена OpIE была используется8,9,10. Таким образом другой переходных ген выражение системы была построена на основе промоутер дрозофилы тепловой шок белка 70 (БТШ70) ген8,9. Промоутер hsp70 работает более эффективно, чем промоутер baculoviral IE когда индуцированных теплового шока на насекомых клетки10. В этой системе были высказаны генов-мишеней под диск промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Чужеродные гены можно легко клонировать в плазмиду выражение переходных генов клонирования методами на основе ПЦР. Кроме того контроль сроков для экспрессии генов может осуществляться тепловой шок индукция.
В настоящем докладе, мы следовать подходу и выразить три различных усечений гена baculoviral (Ингибитор апоптоза 3, iap3 от Lymantria xylina MNPV) с помощью системы выражения на основе шок переходных белка тепла и Далее примените эти выраженной белки на анти apoptotic анализ деятельности. Эта система может либо Экспресс инородные белки быстро или применяться для оценки деятельности анти apoptotic белка в клетках sf9, а также может применяться для других анализов активность белка.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>for insect cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Bioind</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 II SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10902096</td>
			<td>serum-free cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 cell culture flask</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscopy</td>
			<td>WHITED</td>
			<td>WHITED WI-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC HIT Competent Cell</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>RH618-J80</td>
			<td>Escherichia coli (DH5&#945;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L.B. Broth (Miller)</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>LBL407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Bacteriological Grade</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>AGR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>selection antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>PIE25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Gizmo Supply Co</td>
			<td>B-CNT-SLDE-V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Multidish</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>142475</td>
			<td>24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10362100</td>
			<td>cell transfectin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215;SDS Loading Dye</td>
			<td>Bioman</td>
			<td>P1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>PVDF membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell system</td>
			<td>BIO-RED</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Blotting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>6226-79-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-V5</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>V8137</td>
			<td>rabbit anti-V5 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>817072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Multidish</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher</td>
			<td>145380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 % trypan blue solution</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Symbio</td>
			<td>PPS7</td>
			<td>24 well tape ( 19 mm&#215;36 M)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of foreign genes in insect cells (sf9) for protein functional assay

Переходных ген выражение системы является одним из наиболее важных технологий для выполнения функционального анализа белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Эта система была разработана для Экспресс чужеродные гены под контролем промотора baculoviral в переходных выражение плазмид. Кроме того эта система может применяться для функционального анализа бакуловирусы сам или инородные белки. Наиболее широко и коммерчески доступных временных ген выражение системы является разработана на основе незамедлительного начала гена (IE) промоутер Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Однако наблюдается низкий уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых. Таким образом выражение системы переходных ген был построен для улучшения выражения протеина. В этой системе были построены рекомбинантных плазмид содержат последовательности целевых объектов под контролем промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Этот протокол представляет применение этого тепла на основе шок pDHsp/V5-его (V5 epitope с 6 гистидина) /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы; Эта система доступна не только для экспрессии генов, но и для оценки активности анти apoptotic кандидата белков в клетках насекомых. Кроме того эта система либо transfected с одной рекомбинантных плазмид или совместно transfected два потенциально функционально антагонистических рекомбинантных плазмид в клетках насекомых. Протокол демонстрирует эффективность этой системы и обеспечивает практический случай этой техники.

Полная длина и другие два усечения (Бир и кольцо домены) Ly-IAP3 из LyxyMNPV были оверэкспрессировали в sf9 клетках, основанный на теплового шока на основе pDHsp/V5-его /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы. PDHsp/V5-его содержится дрозофилы тепловой шок белка промоутер, котор...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay at JoVE.com

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Этот протокол описывает тепла шок индуцированного белка выражение (система pDHsp/V5-его/sf9 клеток), который может использоваться для выражения инородные белки или оценке анти apoptotic деятельность потенциальных иностранных белков и их усеченного аминокислот кислоты в клетках насекомых.

Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

The overall goal of this heat shock-induced protein expression system is to evaluate protein anti-apoptotic activity in two potentially functionally antagonistic proteins in insect cells. This method can help answer key questions about the functions and activities of candidate proteins in biotechnology and proteomics, such as their anti-apoptotic activities and protein interactions. The main advantage of this technique is that the timing of gene expression is controlled by heat shock induction.So this method can provide insight into protein functional status. It can also be applied to other systems, such as mammalian protein expression. The Spodoptera frugiperda, or Sf9, insect cells used in this protocol are grown in cell culture medium in 25 square centimeter cell culture flasks at 28 degrees Celsius.Shake the cell culture flask to detach the cells from the flask. Then check under a light microscope to make sure that about 80%of the cells are detached. Transfer 50%of the cell suspension to a new 25 square centimeter cell culture flask, and allow the cells to attach at room temperature for 15 minutes.After 15 minutes, replace the medium with five milliliters of fresh culture medium, and grow in an incubator at 28 degrees Celsius. Depending on the cell growth, passage the cells every two to three days. Prior to harvesting the Sf9 cells, it is important to check the cells under the light microscope to make sure that there is no contamination by bacteria or other microorganisms.To harvest the Sf9 cells, shake the culture flask to detach the cells, and then transfer the cell suspension to a 15-milliliter tube. Using a P10 pipette, transfer 10 microliters of the cell suspension to a hemacytometer, and count the cell number under the light microscope. Plate three times 10 to the fifth cells into each well of a 24-well plate, and leave at room temperature for 15 minutes.After 15 minutes, replace the medium with 0.5 milliliters of plating medium. Prepare the cell transfection regent. For each transfection, dilute eight microliters of cell transfection reagent with 100 microliters of serum-free cell culture medium, and vortex for one second to mix.In this study, three different truncations of the baculoviral gene, inhibitor of apoptosis 3, or IAP3, will be expressed under the control of the Drosophila heat shock 70 promoter, the full-length IAP3, a truncation lacking the RING domain, and a truncation lacking the BIR domain. Add two micrograms of each plasmid DNA into 100 microliters of serum-free cell culture medium, and mix by vortexing for one second. Prepare a positive control as well.Combine the diluted plasmid DNA and diluted cell transfection reagent, and mix by vortexing. Incubate at room temperature for 30 minutes. Using a P1000 pipette, add 210 microliters of each DNA transfection reagent mixture dropwise onto the cells.Incubate at 28 degrees Celsius for five hours. After five hours, replace the plating medium with 0.5 milliliters of cell culture medium, and then seal the 24-well plate with tape. Incubate at 28 degrees.On the following day, heat shock to induce protein expression by floating the plate in a 42 degree Celsius water bath for 30 minutes. After 30 minutes, return the 24-well plate to the 28 degree Celsius incubator. Protein expression is subsequently confirmed by Western blot as described in the text protocol.To examine gene-induced cell apoptosis, first prepare Sf9 cells as demonstrated earlier. Next, transfect the cells in the same manner as before, but include one microgram of a plasmid containing an apoptosis inducer gene in each transfection reaction. Incubate at 28 degrees Celsius for five hours, replace the medium, and incubate for 16 hours.Heat shock the transfected cells at 42 degrees Celsius for 30 minutes. Incubate the cells at 28 degrees Celsius for five hours before conducting the cell viability assay. For chemical-induced cell apoptosis, plate one times 10 to the six Sf9 cells into each well of a six-well plate.Leave at room temperature for 15 minutes, and then replace the medium with one milliliter of plating medium. Transfect the cells with four micrograms of each plasmid DNA. After five hours, replace the plating medium with one milliliter of cell culture medium, and incubate the cells at 28 degrees Celsius for 16 hours.Then heat shock at 42 degrees Celsius for 30 minutes. Incubate the cells at 28 degrees Celsius for five hours post-heat shock. Then treat the transfected cells with actinomycin D to induce apoptosis.Incubate at 28 degrees Celsius for 16 hours before conducting the cell viability assay. Begin this procedure by washing the treated cells. Remove the medium from each well, add one milliliter of PBS, and leave for one minute.Wash the cells three times with PBS in this manner. Resuspend the cells in each well with one milliliter of PBS containing 04%trypan blue, and stain at room temperature for three minutes. Transfer the cell suspension into a 1.5 milliliter microfuge tube.Transfer 10 microliters of the trypan blue-stained cell suspension to a hemacytometer, and count the viable intact cells under a light microscope. Finally, perform statistical analysis as described in the text protocol. The full length and two truncations of IAP3 from Lymantria xylina MNPV were overexpressed in Sf9 cells, and Western blot was performed on cell lysates to confirm protein expression.The anti-apoptotic protein Ac-P35 was included as a positive control. All proteins could be detected in transfected cells at either one hour or five hours post-heat shock, with a higher expression at five hours. This system can be adapted to evaluate anti-apoptotic activity.For gene-induced cell apoptosis, the apoptosis inducer Drosophila Reaper was co-transfected with target gene plasmid constructs into Sf9 cells, which were subsequently heat shocked to activate gene expression. Compared to the vector Drosophila Reaper, the positive control showed high anti-apoptotic activity, reaching up to 80%of the viability rate. The other constructs showed various effects on anti-apoptotic activity.For chemical-induced cell apoptosis, only one construct was transfected into Sf9 cells, and actinomycin D was added five hours post-heat shock. Compared to the positive control or the negative control, the other constructs showed various effects on anti-apoptotic activity. Once mastered, this technique can be done in two to three days if it is performed properly.While attempting this procedure, it's important to remember to obey the operation rules of cell culture in laminar flow and check the status of cells diligently. Following this procedure, other methods, such as co-immunoprecipitation, can be performed to answer additional questions, like whether there is any interaction between the two proteins co-expressed in the insect cells. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of biotechnology to explore protein functions in animal or microorganisms.After watching this video, you should have a good understanding of how to use this system to express foreign protein or evaluate potentially functionally antagonistic proteins in insect cells. Don't forget that working with some chemicals, like actinomycin D, can be extremely hazardous, and precautions, such as wearing gloves, should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

В пробирке Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Сохранение биологических культур и измерения экспрессии генов в nerii тля: Non модель системы для взаимодействия растений насекомое

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Обратный Assay транскрипции петля опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) для Зика вирус и уборки генов в моче, сыворотки и пробы москитная

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Определения скорости оплодотворение яйца Bemisia tabaci с помощью цитогенетического техника

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Анализ для количественной протеино-РНК Связывания в бактериях

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Протокол In Vitro для оценки уровней, функций и связанных с ними целевых генов в опухолевых клетках

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...