Name: using crispr/cas9 gene editing to investigate the oncogenic activity of mutant calreticulin in cytokine dependent hematopoietic cells
Uploaded: 2018-01-05T15:00:00
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यह काम NIH (R01HL131835), एक Damon Runyon नैदानिक अंवेषक पुरस्कार और स्टार कैंसर कंसोर्टियम द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. sgRNA डिजाइन ऑनलाइन उपकरण13 का उपयोग
<ol><li>
डिजाइन sgRNAs स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर ब्याज की जीन लक्ष्यीकरण ।
	<ol>
<li>कॉपी और व्यापक संस्थान sgRNA डिजाइनर वेब उपकरण में ब्याज की जी?...

<ol>
	<li>DeWitt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection-free+genome+editing+of+the+sickle+mutation+in+human+adult+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Sci Trans Med. 8, 360 (2016).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).</li><li>Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genetic+silencing+systems+in+bacteria+and+archea.">RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea.</a> Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).</li><li>Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity.">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+(CRISPRi)+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+Gene-knockout+screens+and+target+identification+via+Whole+genome+sequencing+uncover+host+genes+required+for+picornavirus+infection.">CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection.</a> J Biol Chem. 10, 1074 (2017).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancies+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).</li><li>Daley, G. Q., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+an+interleukin+3-dependent+hematopoietic+cell+line+by+the+chronic+myelogenous+leukemia-specific+bcr/abl+protein.">Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148 (2016).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).</li><li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).</li><li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2.">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).</li><li>Elf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Calreticulin+requires+both+its+mutant+C-terminus+and+the+thrombopoietin+receptor+for+oncogenic+transformation.">Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation.</a> Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).</li><li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Genomic+Deletions+in+Mammalian+Cell+lines+via+CRISPR/Cas9.">Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9.</a> J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).</li><li>Watanabe-Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+acquired+mutations+in+transgenes+arising+in+Ba/F3+transformation+assays:+findings+and+recommendations.">Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations.</a> Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).</li></ol>

यहां हम CRISPR/Cas9 जीन संपादन के उपयोग के लिए टेम कोशिकाओं में CALR उत्परिवर्तनों के जैविक समारोह का अध्ययन प्रदर्शन । इस प्रोटोकॉल की सफलता के कई कारकों पर अत्यधिक निर्भर है । सबसे पहले, यह पता है कि उत्परिव...

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी हाल ही में रहने वाले कोशिकाओं और जीवों में लक्षित जीनोम संपादन क्रांति की है । यह जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक अत्यंत शक्तिशाली उपकरण बन गया है और वर्तमान में आनुवंशिक रोगों1की चिकित्सा के लिए एक संभावित एवेंयू के रूप में उपयोग किया जा रहा है । सभी जीनोम संपादन उपकरण के लिए आधार जीनोमिक लोकस में एक nuclease प्रेरित डीएनए डबल असहाय तोड़ (DSB) के निर्माण पर निर्भर करता है संशोधित किया जाना है । DSBs नॉन-मुताबिक़ एंड-जॉइनिंग (NHEJ) या समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR)2,3द्वारा सुधारा जा सकता है । ऐसे जस्ता फिंगर nucleases (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक जैसे प्रभाव nucleases (TALENs) के रूप में अंय जीनोम इंजीनियरिंग nucleases, पर Cas9 nuclease का लाभ एक वांछित डीएनए अनुक्रम को nuclease लक्ष्यीकरण के लिए आरएनए पर अपनी निर्भरता है, तुलना प्रोटीन के लिए-डीएनए ZFNs और TALENs2,3में पाया बातचीत ।
prokaryotic कोशिकाओं में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में CRISPR/Cas9 nuclease मार्ग की खोज के बाद4,5, बहुत प्रयास स्तनधारी सेल लाइनों और मॉडल जीवों2में उपयोग के लिए मार्ग ढालने में चला गया है, 3. जीन संपादन के लिए एक उपकरण के रूप में, CRISPR/Cas9 मार्ग दो मुख्य घटकों का इस्तेमाल करता है: स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes (सपा) Cas9 nuclease और ब्याज2,3के जीन लक्ष्यीकरण sgRNAs व्युत्पंन । sgRNA 20 न्यूक्लियोटाइड के होते है कि आरएनए के माध्यम से जीनोम पर एक विशिष्ट साइट के लिए प्रत्यक्ष Cas9-डीएनए बेस जोड़ी complementarity2,3। sgRNA के लक्ष्य साइट 5 ' NGG, जो SpCas9 nuclease द्वारा मांयता प्राप्त है के रूप में एक protospacer आसंन आकृति (पाम) साइट के निकट झूठ चाहिए । इन उपकरणों के साथ, Cas9 sgRNAs डिजाइन द्वारा किसी भी डीएनए अनुक्रम के लिए निर्देशित किया जा सकता है कि ब्याज के क्षेत्र को लक्षित । एसपी व्युत्पन्न Cas9 के अलावा, विशिष्ट अनुप्रयोग के आधार पर विभिन्न सुविधाओं के साथ Cas9 के लिए अतिरिक्त वेरिएंट हैं. उदाहरण के लिए, पर लक्ष्य संपादन या डीएनए के लिए एकल-किनारा क्लीवेज क्षमता6,7के लिए उच्च विशिष्टता के साथ Cas9 वेरिएंट हैं । इसके अलावा, उत्प्रेरक निष्क्रिय Cas9 हाल ही में transcriptional विनियमन8के लिए विकसित किया गया है । वैज्ञानिकों ने अब ऐसे जीन knockin और नॉकआउट के रूप में आवेदनों की एक किस्म के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली का इस्तेमाल किया है जीन9के जैविक कार्यों का अध्ययन, हानि-समारोह और लाभ के समारोह पुस्तकालय स्क्रीन10 और आनुवंशिक मॉडल जीवों की इंजीनियरिंग11.
इस प्रोटोकॉल में, हम CRISPR/Cas9 पद्धति को बीए/F3 सेलुलर परिवर्तन परख के साथ गठबंधन के लिए CALR उत्परिवर्तनों के जैविक समारोह को समझते हैं । Ba/F3 कक्ष एक murine il-3 निर्भर टेम सेल लाइन है कि BCR-ABL12जैसे कुछ oncogenes की अभिव्यक्ति पर स्वतंत्र IL-3 गाया जा सकता है । आदेश में समझने के लिए कि उत्परिवर्ती calreticulin cytokine स्वतंत्र विकास के लिए बीए/F3 कोशिकाओं को बदल सकते हैं, हम अंतर्जात के एक्सॉन 9 लक्षित Calr/लोकस का उपयोग CRISPR उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए Cas9/ recapitulating लाभ के लक्ष्य के साथ सकारात्मक चयन दबाव, समारोह के CALR उत्परिवर्तनों सीपीसीबी रोगियों में पाया. प्रोटोकॉल डिजाइन, क्लोनिंग और sgRNAs के वितरण, स्थिर Cas9 व्यक्त कोशिकाओं के विकास और CRISPR के लिए स्क्रीनिंग पर लक्ष्य जीन संपादन शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल अलग जीन और विभिंन cytokine ब्याज की सेल लाइनों पर निर्भर लागू किया जा सकता है और विशेष रूप से मॉडलिंग में मूल्यवान है और कैंसर में शामिल जीन के जैविक समारोह का अध्ययन ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>15025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLX_TRC311-Cas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXPR-011</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LentiGuide-Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #52963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 gene editing to investigate the oncogenic activity of mutant calreticulin in cytokine dependent hematopoietic cells

संकुल नियमित रूप से एक अंतराल लघु palindromic दोहराता (CRISPR) prokaryotes में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली है कि वैज्ञानिकों द्वारा आरएनए-निर्देशित nucleases, जैसे CRISPR-संबद्ध (कैस) साइट के लिए विशिष्ट युकेरियोटिक जीनोम के लिए 9 उत्पंन करने के लिए पुनर्जीवित किया गया है संपादन. Cas9 द्वारा जीनोम इंजीनियरिंग कुशलता, आसानी से और मजबूती से कई बायोमेडिकल-प्रासंगिक स्तनधारी सेल लाइनों और जीवों में अंतर्जात जीन को संशोधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यहां हम कैसे CRISPR/Cas9 पद्धति का उपयोग करने के लिए विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के जैविक कार्य को समझने का एक उदाहरण दिखाते हैं । हम मॉडल calreticulin (CALR) murine interleukin में उत्परिवर्तनों-3 (मिल-3) आश्रित प्रो-बी (Ba/एकल गाइड RNAs (sgRNAs) के वितरण द्वारा कोशिकाओं विशिष्ट क्षेत्र में अंतर्जात CALR लोकस लक्ष्यीकरण जहां सम्मिलन और/या विलोपन (indel ) CALR उत्परिवर्तनों myeloproliferative ट्यूमर (सीपीसीबी), रक्त कैंसर का एक प्रकार के साथ रोगियों में होते हैं । sgRNAs डबल किनारा टूट जाता है (DSBs) में लक्षित क्षेत्र है कि गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) के लिए विभिंन आकारों की indels देने के द्वारा मरंमत कर रहे है बनाएं । हम तो टेम सेलुलर परिवर्तन पर Calr उत्परिवर्तनों के शारीरिक स्तर की अभिव्यक्ति के प्रभाव को समझने के लिए मानक बीए/F3 सेलुलर परिवर्तन परख रोजगार । यह दृष्टिकोण अन्य जीनों के लिए लागू किया जा सकता विभिन्न स्तनधारी सेल लाइनों में उनके जैविक समारोह का अध्ययन करने के लिए.

यहां उल्लिखित विधि का उपयोग करते हुए, इस प्रयोग के लक्ष्य को टेम कोशिका परिवर्तन पर अंतर्जात Calr लोकस के लिए indel उत्परिवर्तनों शुरू करने के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन है । CRISPR/Cas9 प्रणाली एक...

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Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 का उपयोग कर लक्षित जीन संपादन बहुत जीन के जैविक कार्यों की समझ में मदद की है । यहां, हम cytokine-निर्भर टेम कोशिकाओं में मॉडल calreticulin उत्परिवर्तनों के लिए CRISPR/Cas9 पद्धति का उपयोग करने के लिए उनके oncogenic गतिविधि का अध्ययन करने के लिए ।

CRISPR/Cas9 जीन संपादन का प्रयोग Cytokine निर्भर टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्ती Calreticulin की Oncogenic गतिविधि की जांच करने के लिए

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

The overall goal of this experiment is to utilize CRISPR/Cas9 gene editing to model calreticulin mutations in cytokine dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity. This method can help answer key questions in the hematological malignancies field such as the biological function of driver mutations when they are expressed at physiological levels. The main advantage of this technique is that it utilizes the CRISPR/Cas9 gene editing system to model and study the biological function of genes involved in cancer.To anneal and phosphorylate the oligos, add the reagents to a total of 10 microliters in a PCR tube kept on ice. Set the program in the thermocycler. Use water to dilute the reaction after cycle is complete.To digest the lentiGuide-Puro vector, prepare 50 microliters of digestor reaction. Then, start the digestion reaction at 55 degrees Celsius at a heat block. After one hour, add an additional microliter of BsmB1 restriction enzyme and continue the reaction for another hour.To dephosphorylate the cut back bone, add seven microliters of phosphatase reaction buffer and two microliters of phosphatase enzyme to the digestive vector. Then, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Purify the already cut and dephosphylated back bone using a commercial kit.To prepare the ligation mixture, add 15 nanograms of digested back bone and other reagents to a PCR tube kept on ice and adjust the volume to 10 microliters with water. Incubate the reaction at room temperature for one hour. Then transform STBL3 compatible cells with two microliters of the ligation mixture.And then plate on the lysogeny broth agar plate containing 100 micrograms per milliliter of ampicillin. After this, incubate the plate overnight at 37 degrees Celsius. Pick three colonies and inoculate them.Perform mini prep for each culture and sequence the oligo insertion site with a U6 promoter region primer. Seed hek293t cells on a 10 centimeter dish. And leave it for overnight incubation.To prepare the DNA mixture for transfection, pipette 45 microliters of the transfection reagent to the DNA. Use a pipette to mix the DNA and transfection reagent carefully, and allow it to stand for 20 minutes. After this, add the DNA transfection mixture drop-wise on the seeded cells.Gently swirl the plates. And incubate at 5%carbon dioxide and 37 degrees Celsius for a day. Harvest the virus containing supernatent after 24 and 48 hours by passing it through a 0.22 micromiter filter.And aliquot 1.6 milliliters of supernatent in each cryo vial. Next aspirate the supernatent and resuspend the Ba/F3 cells in media by pipetting the cells up and down several times. Add 500 microliters of the resuspended cells, 1.5 milliliters of viral supernatant, four microliters of polybrene, and 10 nanograms per milliliter of murine interleukin 3 in a six well tissue culture plate.Centrifuge the plate at 440 G for 120 minutes at 37 degrees Celsius. After centrifugation, transfer the plate to an incubator for overnight incubation at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. After this, spin the cells down at 440 G for three minutes.And resuspend in five milliliters of fresh warm media in a six well plate. To select the Cas9 infected cells, first spin down the cell. And then resuspend in fresh warm media supplemented with five micrograms per milliliter of blasticidin after 48 hours of spinfection.Continue selecting cells for nine days with blasticidin til all the uninfected cells are dead. Then, transfer the resistant cells to a medium with one microgram per milliliter of blasticidin. Transduce the parental cells and the cells stably expressing Cas9 with pXPR-011 reporter construct through lentiviral infection.Continue selecting cells with two micrograms per milliliter of puromycin for three days, 48 hours after spinfection. Infect the Cas9 expressing cells with single guide ribonucleic acid using lentivirus. Then, use two micrograms per milliliter of puromycin to select the cells for three days, 48 hours post spinfection.Bin the exponentially growing Ba/F3 cells expressing ectopic Cas9 and the single guide ribonucleic acid of interest. Aspirate the supernatent and wash the cells with five milliliters of phosphate buffered saline. Spin the cells down, and wash with phosphate buffered saline three times.Then, count the number of cells using a cell viability analyzer. After this, seed cells in triplicates in two milliliters of fresh media without interleukin 3 in six well culture plates. Start monitoring and counting the cells every two days for eight days.Representative flow psychometric data demonstrating Cas9 activity in parental Ba/F3 cell and Ba/F3 overexpressing Cas9 cells is shown here. Green fluorescent protein signal is reduced by 76%in Ba/F3 overexpressing Cas9 cells, indicating robust Cas9 activity, whereas in parental Ba/F3 cells, the green fluorescent protein signal remains at 100%Representative growth curves for cells demonstrating oncogenic activity of calreticulin are shown here. CRISPR/Cas9 mediated plus one base pair frame shift mutation was introduced in the exon nine locus of calreticulin using m1 and m2 single guide RNase.Growth curves for calreticulin targeted Ba/F3 thrombopoietin receptor Cas9 cells shows murine interleukin 3 independent growth. However, the growth curves for the other cell types do not show any cytokine independent growth. Sequencing results confirm the on target editing of endogynous calreticulin exon nine in calreticulin targeted Ba/F3 thrombopoietin receptor Cas9 cells using the m1 and m2 single guide RNase.The plus one base pair frame shift mutations are indicated in black. Once mastered, this technique can be done in two weeks if performed properly. While attempting this procedure, it's important to understand what kind of mutations in the gene of interest may be responsible for the phenotype that is desired.Following this procedure, other methods to further characterize the mutation, such as its role in cell signaling or in protein protein interactions can be performed in order to further understand the mechanism by which is causes disease. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of hematology to explore the effect of gain-of-function mutations at physiological levels on cell transformation in Ba/F3 hematopoietic cells. After watching this video, you should have a good understanding of how to utilize the CRISPR/Cas9 gene editing methodology to investigate the oncogenic activity of gain-of-function mutations in cytokine dependent hematopoietic cells.Don't forget that working with lentivirus can be extremely hazardous and precautions such as working in a BL2 plus facility should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide संवर्धन लेबल के साथ युग्मित मुक्त मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोस्टेट कैंसर में Phosphoproteome की जांच करने के लिए

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

आनुवंशिक निर्भरता की जांच CRISPR-Cas9-आधारित प्रतियोगिता परख का उपयोग

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CAR-T सेल में जीएम-सीएसएफ को नॉक आउट करने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करना

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Oncogenic जीन फ्यूजन जांच लंगर मल्टीप्लेक्स पॉलिमरेज चेन रिएक्शन का उपयोग अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा पीछा किया

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

कैंसर के इलाज के लिए साइटोटॉक्सिक साइटोकिन-प्रेरित किलर टी कोशिकाओं का अलगाव और विस्तार

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण का उपयोग करके अव्यवस्थित ओंकोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के संरचना-फ़ंक्शन संबंधों का मानचित्रण

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच के लिए समीपस्थ तरल पदार्थ का अलगाव

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...