Name: isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Maine Medical Center Research Institute.
1. verzameling buizen voorbereiding
<ol><li>Maken de BMSC cultuurmedia door Minimum essentiële Medium α (MEM α) aan te vullen met 10% foetale runderserum en 1% van penicilline/streptomycine.</li>
	<li>Plaats 100 µL van de voedingsbodems BMSC in 1,5 mL microcentrifuge buizen. 3 beenderen past meestal in een enkele buis dus bereiden dienove...

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

In dit artikel worden twee methoden van cultuur van de BMSCs gepresenteerd met hun voordelen en beperkingen. Isoleren van cellen uit het beenmerg is een relatief eenvoudig proces. Verkrijgen van een vertegenwoordiger van de mesenchymale stamcellen of osteoclastic progenitoren celpopulatie kan echter uitdagende als gevolg van de verschillende cellulaire omgeving van de holte van het beenmerg.
Kweken van het geheel van de inhoud van het beenmerg biedt een nauwe weergave van de communicatie i...

Primaire lymfkliertest BMSCs worden vaak gebruikt als een in vitro model van mesenchymale stamcellen sinds hun ontdekking in de vroege jaren 19801. Inderdaad, culturen van kunststof-aanhanger cellen uit het beenmerg holte van lange beenderen gespoeld handhaven de capaciteit te differentiëren in botcellen, osteoclasten, chondrocyten of adipocytes in vele studies2,3, 4 , 5. het beenmerg is echter een unieke weefsel bestaat uit veel verschillende cel populaties, inclusief, maar niet beperkt tot, BMSCs, HSCs, endotheel en immuun cellen. Dus, isolatie en cultuur technieken kunnen opleveren cel populaties met verschillende homogeniteit. Met behulp van deze technieken voor het testen van de mogelijke differentiatie van cellen kan worden uitdagende. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van cellen uit muizen met verschillende genotypen, beginnend met een gemengde celpopulatie beperkt de interpretatie van de gegevens. Omgekeerd, verkrijgen van homogene bevolking van BMSCs en HSCs kan technisch moeilijk en mogelijk niet als vertegenwoordiger van een ex vivo -model.
In ons laboratorium zijn we voornamelijk geïnteresseerd in het gebruik van BMSCs als gevolg van hun potentieel te differentiëren in botcellen, osteoclasten en adipocytes. Hier presenteren we technieken van BMSCs en HSCs isolement en cultuur gebruikt om te beoordelen osteoblastogenesis of adipogenesis in vitro, evenals de culturen van HSCs te onderscheiden in de osteoclasten. Één methode gebruikt een gemengde bevolking van beenmergcellen (BMCs) met BMSCs en HSCs direct geschikt voor adipogenesis, osteoblastogenesis, en osteoclastogenesis (totale BMCs genoemd). Deze methode is een nauwere ex vivo representatie van de heterogeniteit gevonden onder de cellen van het beenmerg-communicatie. Een andere methode scheidt aanhanger uit niet-aanhanger cellen in een poging aan cultuur "zuiverder" bevolking van BMSCs en HSCs (aanhanger BMSCs genoemd). De latere methode kan de celcultuur experimenten om te starten met een meer nauwkeurige aantal BMSCs of HSCs en vermindert het potentieel van complexe indirecte effecten van andere cel populaties die in de cultuur blijven. Beide methoden zijn eerder gepubliceerd en gebruikt om verschillende onderzoek vragen6,7,8,9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200&#956;L pipet tips&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">17014401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Science</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m filters</td>
			<td style="width:135px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% trypsin</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:135px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Nitrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter Grade 1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:135px;">Electron</td>
			<td style="width:119px;">16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM&#945;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rosiglitazone</td>
			<td style="width:135px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">717410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IBMX</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RANKL</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mCSF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axio Observer inverter microscope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Het beenmerg stromale cellen (BMSCs) vormen een celpopulatie routinematig gebruikt als een vertegenwoordiging van mesenchymale stamcellen in vitro. Ze bevinden zich in de holte van het beenmerg naast hematopoietische stamcellen (HSCs), die aanleiding tot rode bloedcellen, immuun progenitoren en osteoclasten geven kunnen. Dus, extracties van cel populaties uit de resultaten van de beenmerg in een zeer heterogene mix van diverse cel populaties, die kan uitdagingen aanwezig in experimenteel design en data interpretatie beschamen. Diverse isolatie en cultuur technieken zijn ontwikkeld in laboratoria met het oog op een min of meer homogene bevolking van BMSCs en HSCs invitro. Hier presenteren we twee methoden voor het isoleren van BMSCs en HSCs van lange beenderen van de muis: een methode die resulteert in een gemengde bevolking van BMSCs en HSCs en één methode die probeert te scheiden van de twee cel populaties gebaseerd op naleving. Beide methoden worden verkregen cellen geschikt voor osteogenic en adipogenic differentiatie experimenten zo goed als functionele testen.

Overzicht van de celculturen De twee cultuur technieken laten de beoordelingvan differentiatie op een gemengde populatie van BMCs bestaat uit BMSCs en HSCs (totale BMCs, figuur 1A) of een bevolking van BMSCs afgesplitst van HSCs (aanhanger BMSCs, figuur 1B). 48 hr na de cellen uit het beenmerg geïsoleerd worden en verguld (Figuur 1 c), ze snel hechten aan de onderkant van de plas...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice at JoVE.com

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden van klonterde beenmergmonsters

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...