Name: isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di utilizzo presso il Maine Medical Center Research Institute e istituzionali Animal Care.
1. la raccolta di tubi preparazione
<ol><li>Rendere i terreni di coltura BMSC completando α Medium essenziale minimo (MEM α) con 10% siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Posto 100 µ l di terreno di coltura BMSC in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. 3 ossa solitamente si adattano in una singola provet...

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

In questo articolo, sono disponibili due metodi di coltura di BMSC con i loro vantaggi e limitazioni. Isolamento di cellule provenienti dal midollo osseo è un processo relativamente semplice. Tuttavia, ottenere una popolazione di cellule rappresentativa della cellule staminali mesenchimali o progenitori osteoclastic può essere difficile a causa di vario ambiente cellulare della cavità del midollo.
La totalità del contenuto del midollo osseo la coltura fornisce una rappresentazione stretta ...

BMSCs murino primario sono comunemente usati come modello in vitro di cellule staminali mesenchimali fin dalla loro scoperta nel primi anni 19801. Infatti, colture di cellule di plastica-aderente svuotate dalla cavità del midollo osseo delle ossa lunghe mantengono la capacità di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti, condrociti o adipociti in molti studi2,3, 4 , 5. Tuttavia, il midollo osseo è un tessuto unico composto di molte popolazioni differenti delle cellule, tra cui, ma non limitato a, BMSC, HSCs, cellule endoteliali ed immuni. Così, isolamento e tecniche di coltura possono portare a popolazioni di cellule con diverse omogeneità. Utilizzando tali tecniche per testare il potenziale di differenziazione dalle cellule può essere impegnativo. Ad esempio, quando si confrontano le cellule dai topi con genotipi differenti, a partire con una popolazione di cellule miste limita l'interpretazione dei dati. Al contrario, ottenere popolazioni omogenee di BMSC e HSCs può essere tecnicamente difficile e potrebbe non essere più rappresentativo di un modello ex vivo .
Nel nostro laboratorio, siamo principalmente interessati nell'utilizzazione di BMSCs a causa del loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti e adipociti. Qui, presentiamo tecniche di isolamento BMSCs e HSCs e impostazioni cultura utilizzate per valutare osteoblastogenesis o adipogenesis in vitro, così come le culture di HSCs per differenziarsi in osteoclasti. Un metodo utilizza una popolazione mista di cellule del midollo osseo (BMC) contenente BMSCs e HSCs direttamente adatto per adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chiamato BMCs totale). Questo metodo è una rappresentazione più vicina ex vivo dell'eterogeneità tra le cellule del microambiente midollare. Un altro metodo separa aderente da cellule non aderenti nel tentativo di popolazioni "pure" coltura di BMSC e HSC (chiamato aderente BMSCs). Il metodo successivo consente la coltura delle cellule esperimenti per iniziare con un numero più preciso di BMSCs o HSCs e riduce il potenziale di effetti complessi indiretti di altre popolazioni di cellule che rimangono nella cultura. Entrambi i metodi sono stati precedentemente pubblicati e utilizzati per indirizzo ricerca diverse domande6,7,8,9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200&#956;L pipet tips&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">17014401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Science</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m filters</td>
			<td style="width:135px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% trypsin</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:135px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Nitrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter Grade 1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:135px;">Electron</td>
			<td style="width:119px;">16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM&#945;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rosiglitazone</td>
			<td style="width:135px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">717410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IBMX</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RANKL</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mCSF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axio Observer inverter microscope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Cellule stromali del midollo osseo (BMSC) costituiscono una popolazione di cellule ordinariamente utilizzata come rappresentazione delle cellule staminali mesenchimali in vitro. Essi risiedono all'interno della cavità del midollo osseo al fianco di cellule staminali ematopoietiche (HSCs), che possono dare origine a globuli rossi, dei progenitori immuni e gli osteoclasti. Così, le estrazioni delle popolazioni delle cellule dai risultati del midollo osseo in un mix eterogeneo di varie popolazioni di cellule, che possono presentare sfide nel disegno sperimentale e confondere l'interpretazione dei dati. Diversi di isolamento e tecniche di coltura sono state sviluppate nei laboratori al fine di ottenere popolazioni più o meno omogenee di BMSC e HSCs invitro. Qui, presentiamo due metodi per l'isolamento di BMSC e HSCs da ossa lunghe del mouse: un metodo che produce una popolazione mista di BMSC e HSCs e un metodo che tenta di separare le due popolazioni di cellule basato su aderenza. Entrambi i metodi forniscono adatto per le cellule osteogeniche e adipogenico differenziazione esperimenti saggi anche come funzionali.

Panoramica delle colture cellulari Le tecniche di due cultura permettono la valutazione di differenziazione su una popolazione mista di BMCs composto da BMSC e HSC (BMCs totale, Figura 1A) o di una popolazione di BMSCs diviso da HSC (BMSCs aderente, Figura 1B). 48 ore dopo che le cellule dal midollo sono isolate e placcato (Figura 1), essi rapidamente fissare alla parte inferiore ...

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...