Name: the establishment of a lung colonization assay for circulating tumor cell visualization in lung tissues
Uploaded: 2018-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Чан Минь-мин и г-жа Ya-синь Чэн за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (большинство-103-2325-B-006-009, большинство-104-2325-B-006-001, большинство-105-2325-B-006-001 и MOST-106-2320-B-006-068-MY3) и Министерство здравоохранения и социального обеспечения (MOHW106-TDU-B-211-144004). Мы признательны также за поддержку от основной научно-исследовательской лаборатории колледжа медицины, Национальный университет Ченг Кунг, за их участием Фотон конфокального микроскопа.

Все эксперименты на мышах были исполнены в соответствии с руководящими принципами нашего института (руководство для ухода и использования лабораторных животных, NCKU медицинский колледж).
1. Подготовка документов, средства массовой информации культуры и блюда
<ol><li>Перед ...

Наряду с давно термин легких колонизации анализов, короткий срок методологии мы здесь оценить в естественных условиях легких колонизации ЦОК в отдаленных органах явно обнародовал и дифференцированной конкретная роль polyFN, собрал на ЦОК в колонизации легких, которые затем привели ...

Метастазирование является основной причиной рака смерти1,2. Опухолевые клетки, полученные из основной ткани введите тираж в суспензии и выжить различных гематогенного вызовы, например, anoikis, иммунных нападений и убытки из-за напряжения сдвига от кровяного давления или геометрических зависимостей, прежде чем они возможность колонизировать отдаленные органы, ключевой шаг диктуют успех метастазированием3,4,5,6. Таким образом энергичные усилия в настоящее время достигнут в характеристике циркулирующих клеток опухоли (CTCs) и соотнося эти характеристики с злокачественности опухоли, метастазы и выживаемость больных раком7,8 , 9. Поскольку процесс метастазирования рака специально изображает события в естественных условиях , Животные модели являются единственный подход, который захватывает полный системный процесс метастазирования10,11,12 .
ЦОК стать метастатические опухоли тканей через несколько клеточных события, включая колонизации отдаленные органы1,2. Однако наиболее часто используемых метастазов анализов13,,1415 не позволяют соблюдать КТК колонизации отдаленные органы. Таким образом срочно необходима в vivo пробирного дизайн для визуализации колонизации КТК. Хотя несколько in vivo и ex vivo короткий срок легких колонизации, анализы были разработаны, проблемы и недостатки остаются. Например, в то время как зеленый флуоресценции белков (ГПУП)-избытком опухолевые клетки были использованы в эти assays22,23, это занимает время стабильно transfect и клонировать опухолевых клеток с достаточной интенсивности флуоресценции GFP под Микроскоп. Аналогичным образом, хотя переходные окрашивание опухолевых клеток с трассирующими сотовый долгосрочной перспективе CFSE был нанят для замены GFP-выражая опухолевых клеток, он по-прежнему трудно судить, присоединены ли CFSE-меченых опухолевые клетки или просто присутствует в сосудистую подакцизным отдаленные органы16,17.
Было установлено, что полимерные фибронектина (polyFN) собрал на поверхностях CTCs критически внести вклад в окончательное создание метастатические опухоли тканей18,19,20,21,22 . Здесь мы провели короткий срок легких колонизации анализов в которых приостановлено Льюис легких карцинома клетки (LLC) стабильно выражая FN-индуцируемый (shFN) или схватка индуцируемый (shScr) и предварительно помечены CFSE внутривенно были привиты в мышей C57BL/6. После 2-3 дня легкие мыши были впервые увлажненную с-фосфатный буфер (PBS), чтобы полностью удалить неприсоединенной ЦОК в сосудистую прежде чем подвергнуться confocal микроскопии и количественная оценка легких колонизировать LLC. Мы ясно показали, что количество легких колонизировать shFN LLC и узелки опухоли были значительно снижены по сравнению с shScr LLC, существенно подтверждающих роль polyFN Ассамблеи на ЦОК в деле содействия колонизацией и рост ЦОК в легкие. Наше исследование заслуживает дальнейшего расследования для роли polyFN в рак метастазы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Fluid</td>
			<td>MCC(medical chemical corporation)/POISON</td>
			<td>456-A-1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation Dye</td>
			<td>ebiosciences</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td>Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media (DMEM)&#160;</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-6381-92-6</td>
			<td>For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM )&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis lung carcinoma (LLC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CRL-1642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, USP&#160;</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21051-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7447-40-7</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7778-77-0</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7647-14-5</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-10039-32-4</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6146</td>
			<td>0.5 g mix with 100 mL 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4799</td>
			<td>For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>Virbac</td>
			<td></td>
			<td>To dilute with 1X PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Tabletop Centrifuge 2420</td>
			<td>KUBOTA Co.</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (6cm)</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe (with needle)</td>
			<td>Perfect Medical Industry Co.</td>
			<td></td>
			<td>24G/3 cm;3 ml &#38; 26G/0.5 cm;1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End over end mixer</td>
			<td>C.T.I YOUNG CHENN</td>
			<td>TS-20</td>
			<td>For suspended cells recovery&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur (FACS)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td>10.102.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>HEPA CLASS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Confocal Microscope BX61WI</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td>08.370.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures&#160;</td>
			<td>UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO.</td>
			<td>NO. 0034</td>
			<td>Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Greiner tube</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the establishment of a lung colonization assay for circulating tumor cell visualization in lung tissues

Метастазирование является основной причиной смерти от рака. Энергично исследована роль циркулирующих опухолевых клеток (CTCs) в содействии метастазов рака, в котором легких колонизации CTCs критически способствует метастатических процессов раннего легких. Таким образом Животные модели являются единственный подход, который захватывает полный системный процесс метастазирования. Учитывая, что проблемы возникают в предыдущих экспериментальные проекты для изучения вклад ЦОК в кровеносный сосуд кровоподтек, мы создали assay колонизации в естественных условиях легких в котором долгосрочной перспективе флуоресценции клеток трассирующими, Карбоксифлуоресцеина Эстер succinimidyl (CFSE), была использована для ярлык приостановлено опухолевых клеток и легких перфузии была исполнена очистить-специально в ловушке CTCs до легкого удаления, конфокальная томография и количественной оценки. Было установлено, что полимерные фибронектина (polyFN) собрал на поверхностях КТК посредником легких колонизации в окончательном создании метастатические опухоли тканей. Здесь, чтобы специально проверить требования polyFN Ассамблеи на CTCs для легких колонизации и кровоподтек, мы провели короткий срок легких колонизации анализов в которой приостановлено клеток карциномы легкого Льюис (LLC), стабильно выражая FN-индуцируемый (shFN) или схватка индуцируемый (shScr) и предварительно помечены с 20 мкм CFSE внутривенно были привиты в мышей C57BL/6. Мы успешно продемонстрировали, что способности клеток shFN ООО колонизировать мыши легких значительно сократились по сравнению с shScr ООО клетки. Таким образом это краткосрочные методологии могут широко применяется конкретно продемонстрировать способность ЦОК в циркуляции колонизировать легких.

Перед выполнением assay колонизации в естественных условиях легких как показано на рисунке 1A для проверки ли polyFN на взвешенных опухолевые клетки опосредует легких колонизации и/или кровоподтек в содействии метастазов, мы сначала титруют различных ...

Watch this Scientific Journal Video about The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues at JoVE.com

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Животной модели необходимо расшифровать роль циркулирующих опухолевых клеток (CTCs) в содействии легких колонизации во время метастазов рака. Здесь мы создали и успешно выступила в естественных условиях анализа специально тест требование Ассамблеи полимерных фибронектина (polyFN) на CTCs для легких колонизации.

Создание колонизации Assay легких для циркулирующих визуализации опухолевых клеток в тканях легких

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

This method can help answer key questions in the cancer metastasis field about the role of lung colonization in accomplishing cancer metastasis. The main advantage of this technique is that early extravasated cancer cells can be visualized in the lungs during cancer metastasis. Demonstrating the procedure will be Cheng-Han Yang, a PHD student from my laboratory.When the tumor cell culture has reached 70 to 80 percent confluence, wash the culture two times in two milliliters of sterile PBS per wash, and add one milliliter of 0.5%Trypsin-EDTA to the culture dish. Immediately remove 800 microliters of the supernatant and place the culture dish at 37 degrees Celsius for 30 to 60 seconds until the majority of the cells have detached from the plate. Add one milliliter of fresh medium, supplemented with 10%FBS to stop the reaction and use a 1000 microliter pipette to vigorously mix the cell solution.Transfer the resulting single-cell suspension into a 1.5 milliliter micro centrifuge tube and collect the cells by centrifugation. Then re-suspend the tumor cell pellet in 1.5 milliliters of medium supplemented with 20%FBS, and end-over end rotate the cells for two hours, at 37 degrees Celsius. At the end of the incubation, count the viable cells by trypan blue exclusion and collect them by centrifugation.Re-suspend the pellet in one milliliter of sterile PBS for a second centrifugation and re-suspend the pellet in 500 microlitres of PBS supplemented with 10%FBS and 20 micro milliliter CFSE. After ten minutes at 37 degrees Celsius in the dark, centrifuge the cells, and re-suspend the pellet in four milliliters of medium supplemented with one percent FBS for another centrifugation. After the last wash, re-suspend the cells to a five times ten to the sixth tumor cells per milliliter of fresh medium without FBS concentration, and place the cells on ice.Next, warm the tail of a four to six week old male C570 Black Six mouse for five to ten minutes to dilate the tail veins and use a one milliliter syringe equipped with a 26 and a half gauge needle to thoroughly mix the cells until a single cell suspension is achieved. Carefully load the syringe with 200 microliters of cells and place the mouse in a restrainer. Then inject the entire volume of cells into the lumen of a dilated tail vein.At the appropriate post-injection time point, make a longitudinal skin and subcutaneous tissue incision from the abdomen to the chest and open the pleural cavity to expose the heart and lungs. Using sterile surgical sutures, ligate the superior and inferior vena cavas to prevent the backflow of the profusion solution and use scissors to make a two to four millimeter fissure in the left ventricle to facilitate draining of the perfusate from the lungs. Then use a three milliliter syringe to inject PBS into the right ventricle and use continuous suction to remove the drained solution until the lungs change from a reddish color to completely pale.Take care to secure the superior and inferior vena cava properly for a successful lung perfusion. After harvesting the lungs, place the lobes in a custom-made lung holder in a six centimeter dish, and secure the lungs onto the reticulated texture of the holder. Cover and moisten the lobes with PBS, and place the culture dish on the imaging stage of a confocal microscope.Select the 5x objective, and rotate the filter wheel to NIBA. Using a 488 nanometer laser, excite the CFSE to allow a clear visualization of the florescent blue labeled tumor cells within the lung lobes. Rotate the filter wheel to R690 to scan with a two microseconds per pixel scanning speed and optimize the high voltage gain and offset levels.Then capture five 12 by five 12 pixel fluorescent images using a 10 microsecond per pixel scanning speed. Using the staining method as just demonstrated the tumor cells are effectively labeled with CFSE in a dose-dependent manner. With the fluorescence intensity of the labeling, almost reaching a plateau in six times 10 to the fifth Lewis lung carcinoma cells per milliliter at the 20 micromolar concentration.Lung perfusion before harvest as just demonstrated clears the lung vasculature of non-specifically chopped circulating tumor cells prior to imaging analysis. Fluorescence confocal microscopy reveals the presence of the colonizing CFSE-labeled tumor cells within the harvested and perfused lung lobes. Using an appropriate image analysis software program to convert the fluorescent images to black and white, facilitates quantification of the lung colonization.Intravenous delivery of fibronectin expressing or scrambled fibronectin expressing Lewis lung carcinoma cells demonstrates a significantly lower number of fibronectin expressing cells in lung tissue harvested 38 and 45 hours after injection, underscoring the role of fibronectin in lung lobe colonization and tumor development. While attempting this procedure, it's important to remember to carefully perfuse the lungs so that the unattached cells can be washed away. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of cancer metastasis to explore lung colonization by circulating tumor cells in a mouse zero gram model.After watching this video, you should have a good understanding of how to fluorescently label tumor cell suspensions, intravenously inoculate the tumor cells perfuse mouse lungs, and use confocal florescence microscopy to image the metastasized tumor cells.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Assay набора клетки опухоли легких

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Цифровой анализ иммуностоинга взаимодействующих белков в тканях легких человека

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Обнаружение и мониторинг опухолев, связанных с циркуляцией ДНК в биожидкости пациентов

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Полуавтоматический PD-L1 Характеристика и перечисление циркулирующих опухолевых клеток от немелкоклеточных больных раком легких по иммунофлуоресценции

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Обнаружение прогрессирования опухоли легких у мышей с помощью ультразвуковой визуализации

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Перфузия и инфляция мышиного легкого для гистологии опухолей

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...