Name: long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Støtte af NSF (EPSCoR EPS-0814251) og NIH (1P20GM103653-01A1) til MKT og HSD, Delaware State Universitys institutionelle studentersupport MDM (afsnit III HBGI) og KRS (NIH-INBRE) anerkendes taknemmeligt. Tak til C. elegans genetisk Center (støttet af forskning infrastruktur programmer P40 OD010110 NIH kontor) for C. elegans vildtype N2 stamme.

Protokollerne nedenfor er blevet standardiseret for at afprøve virkningerne af BPA eksponering under tidlige embryogenese, og kan ændres til brug med BPS, BPF eller andre EDC og giftige stoffer på C. elegans embryoner.
1. materielle Setup
<ol><li>Forberede 500 mL af fyrretræsnematoden vækst medier (NGM)18 medier ved at opløse 1,5 g NaCl, 1,25 g af pepton og 8,5 g agar i vand til 500 mL. Efter autoklavering (121 ° C, 15 PSI, 20 min), der tilsættes 0,5 mL kolesterol (5 mg/mL ethanol), 0,5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL 1 M CaCl2 og 12,5 mL 1 M kalium fosfat buffer, pH 7,4 (108.3 g af KH2PO4 35,6 g K2HPO4, vand til 1 L).</li>
	<li>Forberede hypokloritiske løsning ved at blande 25 mL 1 N KOH, 4 mL af blegemiddel og 71 mL vand. Gør denne løsning frisk.</li>
	<li>Forberede M9 Buffer ved at blande 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO,4, 5 g NaCl, 5 mL 1 M MgSO4, og vand til 1 L.</li>
	<li>Forberede S Buffer18 ved at blande 129 mL 0,02 M K2HPO4, 871 mL KH2PO4og 5.85 g NaCl.</li>
	<li>Sterilisere M9 og S buffere ved autoklavering.</li>
	<li>Vokse en overnight kultur af Escherichia coli (OP 50 stamme) i 20 mL af Luria bouillon (LB).</li>
	<li>Opløse BPA i 10% ethanol til at gøre en 1 mM stamopløsning. Gøre efterfølgende fortyndinger af 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM og 10 µM i S buffer. Bemærk: Fortynding i vandig S bufferen reducerer koncentrationen af ethanol; for eksempel, med den højeste BPA koncentration er beskrevet i denne protokol (10 µM), er koncentrationen af ethanol 0,1% v/v.</li>
</ol>2. C. elegans Culturing og synkronisering
<ol><li>Hæld NGM medier i 100 mm plader (ca. 25 mL/plade) og lad den størkne. Når størknede, seed pladerne ved at sprede 150 µL af E. coli OP50 fra den flydende kultur dyrkes natten over. Inkuber plader ved 37 ° C natten over.</li>
	<li>Den næste dag, overføre N2 orme på de nye plader ved chunking en omtrentlig slab af 1 cm square. Tillad orme at vokse i 3 dage ved 20 ° C, indtil pladen er befolket med velnærede modne voksne der indeholder synlige embryoner.</li>
	<li>Vask hver plade for at synkronisere, når der afpipetteres 5 mL af M9 buffer på tværs af pladen. Væsken overføres til et sterilt 15 mL konisk centrifugeglas. Bemærk: Synkronisering er gjort for at dræbe voksne orme og indsamle embryoner, der er forholdsvis den samme fase.</li>
	<li>Der centrifugeres ved 3.000 x g i 4 min ved stuetemperatur for at opnå en løs pellet af voksne orme.</li>
	<li>Ved hjælp af 10 mL pipette, forsigtigt fjerne supernatanten således at forlade pellet intakt. Tilsættes 5 mL af hypokloritiske og bland forsigtigt.</li>
	<li>Der centrifugeres ved 3.000 x g ved stuetemperatur i 4 minutter.</li>
	<li>Fjern supernatanten med 10 mL pipette og vask med 7 mL af M9 buffer. Gentag dette trin to gange.</li>
</ol>3. udsætter orme til BPA
<ol><li>Efter den sidste vask fra trin 2.7 ovenfor, suspendere omkring 100 µL af æg med M9 buffer. Overføre omkring 50 µL af æg til 2 mL mikrofuge rør allerede indeholdende den passende koncentration BPA fortyndet i S buffer. Justere mængden af S-buffer til at sikre den korrekte endelige koncentration af BPA (0.0 µM, 0,1 µM, 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM og 10 µM) pr tube. Tabel 1 viser en måde at gøre disse fortyndinger.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>For endelige BPA koncentration</td>
			<td>Stock BPA (100 μM)</td>
			<td>S Buffer</td>
			<td>Synkroniseret orme</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>850 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Materiel BPA, S buffer og synkroniseret orme bruges til at opnå de ønskede koncentrationerne anvendes til vores undersøgelse.
<ol start="2"><li>Sted rør på en shaker og Ryst forsigtigt i 4 timer ved 20° C, på 25 rpm for en orbitalryster eller 25 vipper/min for en vuggende shaker.</li>
	<li>Efter 4 h, placere rør i rør indehavere og tillade orme til at bilægge.</li>
	<li>Kassér supernatanten og overføre orme til seedede plader (NGM plader med OP50 E. coli). Gøre den flydende OP50 E. coli kultur som anført i 1,5 og seed pladerne, som anført i punkt 2.1.</li>
	<li>Lad ormene vokse til 60 h i 20 ° C. Undersøge plader hver dag for forurening. Forurenet NGM plader er normalt misfarvet og ledsaget af enkelte kolonier. Kontrollere orme under mikroskop for overbelægning. Manglende OP50 E. coli græsplæne og koncentreret orme i små steder betyde overbelægning.</li>
</ol>4. forreste Touch tilvænning Assay
<ol><li>Overføre ca 10 synkroniserede unge voksne orme til nye unseeded NGM plader ved hjælp af en brand-steriliseret 30 G platin wire vælge. Forlade orme uforstyrret i 5 min at give dem tid til at akklimatisere til den nye plade.</li>
	<li>For tilvænning svar, brug en øjenbryn hår knyttet til slutningen af en træ spyd eller tandstikker og sterilisere ved dypning i 70% ethanol. Tør med en ren fnugfri serviet og vente på 1 min til ethanol til at fordampe ud. Blidt røre orm i hovedet (forreste af svælg pæren) ved hjælp af øjenbryn hår. Gentag rører, tillader 10 s mellem rører således at ormen at inddrive.</li>
	<li>Fortsætte med at røre ved (tillader 10 s interstimulus intervaller) indtil ormen ikke længere bevæger sig baglæns. På dette punkt har ormen vænnes til stimulus. Registrere antallet af rører kræves for ormen til habituate.</li>
	<li>Analysere forskellen mellem de gennemsnitlige tilvænning priser behandlet og ubehandlet kontrol ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey's post hoc test.</li>
</ol>5. orm frugtbarhed Assay
<ol><li>Overføre enkelte L3 orme til en frisk og seedet plade ved hjælp af en platin pick. Sørg for, at kun en orm er placeret pr. plade. Bemærk: efter L3 larve stadie, orme udvikle sig til L4 larver fase og voksenliv. Plukke dem tidligt er praktisk, idet de er store nok til overførsel af enkelte dyr samtidig med at de allerede ikke har fastsat nogen æg, som ellers ville blive savnet i optællingen.</li>
	<li>Tæl antallet af æg lagt hver 12-24 h. Efter optælling, skal du overføre ormen forælder til en ny plade. Gentag indtil orm stopper lægge æg, typisk efter 5 dage når inkuberes ved 20 ° C. Bemærk: I gennemsnit en vildtype orm kan lægge op til 300 æg; Derfor, overføre forælderen til en ny plade dagligt forhindrer overbelægning.</li>
	<li>Analysere forskellen mellem den gennemsnitlige antal æg lagt af behandlede og ubehandlede kontrollen ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey's post hoc test.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har noget at oplyse.

Faser af hurtig vækst og udvikling såsom embryogenese er særligt sårbare over for de skadelige virkninger af forskellige hormonforstyrrende stoffer, herunder BPA. Vi leverer detaljerede protokoller for at studere virkningerne af eksponering for BPA eller andre giftige stoffer i C. elegans hvirvelløse model, som giver mulighed for bekvem titrering af en række koncentrationer at vurdere dens virkninger på embryo levedygtighed (figur 2) . Følge op på adfærdsmæssige eksperimenter på overlevende voksne, der udvikler fra embryoner, blev udsat for lave doser af BPA tillade boltpistoler langtidseffekter på neuronal funktion (figur 3). Den centrale idé i dette papir er at give detaljerede protokoller for udsætter embryoner til forskellige giftstoffer i den tidlige embryogenese periode i C. elegans model; de første 4 h vindue i sine 11,5 time fosterudviklingen periode (ved 20 ° C) svarer til perioden spredning, som er efterfulgt af organogenesis. I denne retning, har vi givet validering af slutpunkter gennem frugtbarhed og associative læring assays. Mens den mekanistiske grundlag af virkningen af BPA og andre uvæsentligt er den hellige gral som forskning på dette område har til formål, har vi ikke forsøg på at tilbyde en mekanistisk forklaring på virkningen af BPA i denne metode fokuseret artikel. Vi vil dog gerne påpege, at C. elegans modellen tilbyder et ideelt system for at yderligere dissekere virkningsmekanisme. For eksempel, i fremtiden arbejde på decifrere BPA virkningsmekanismer, C. elegans mutanter kan genereres og screenes for en modstand mod virkningerne af BPA og dermed bane vejen for decifrere vej. Derudover omhandler vores følgesvend papir effekt af BPA på neurale netværk synchrony niveau i hvirveldyr, giver en anden avenue for at forstå grundlaget for at undersøge potentielle mekanismer for giftstof effekter19.
I den metode, der beskrevet i dette papir, nogle af de vigtige skridt, der skal udføres ekstra omhyggeligt, omfatter følgende: at vælge en plade med velnærede C. elegans voksne med modne æg synlige mikroskopet dissektion er afgørende, og ikke at fÃ¸lge dette trin vil resultere i en utilstrækkelig stikprøvestørrelse af embryoner til EDC eksponering eksperiment. Det er også vigtigt at sørge for, at den hypokloritiske løsning er frisklavet undgå at få en ikke-synkroniserede befolkning, der vil forstyrre evnen til at udføre BPA eksponering under tidlige embryogenese. Vask pellets med M9 (efter hypokloritiske eksponering) er også et meget vigtigt skridt. Hvis det ikke gøres ordentligt, kan den høje koncentration af blegemiddel resultere i døde embryoer. Derudover skal embryoner overføres til seedede NGM plader efter 4 h. Hvis venstre i BPA løsning for en længere periode, er at embryonerne tilbøjelige til at udvikle til langlivede dauer larver. Dette påvirker væsentligt frugtbarhed assay og adfærdsmæssige assays. Hvis nogen af disse skridt er savnet, er det tilrådeligt at starte proceduren helt fra begyndelsen. Hvis en eller anden grund, NGM plade med orme er forurenet eller ikke har nok mad, vil det tilføje stress på ormene dermed skævvridning de indsamlede data. Sådanne plader skal kasseres og anvendes ikke i forsøget.
Tidligere, en bemærkelsesværdig undersøgelse med held brugt C. elegans model for at demonstrere at kromosom abnormiteter forårsaget af BPA resultat på grund af fordelingen af DNA reparation maskiner i kønscelleoverførsel14. Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at den ovennævnte undersøgelse design havde brugt kontinuerlig BPA eksponering af C. elegans høje doser af BPA i hele dens levetid. Vores metode var designet til at studere lave doser af BPA eksponering under tidlige embryogenese, således at analysen dens virkninger på embryonale levedygtighed og finere langtidseffekter på overlevende. Til vores viden, er ingen metode blevet udviklet for at afsløre tidlige fase embryoner til meget lave doser af BPA begrænset til en bestemt periode; således præsenteres gør metoden her roman.
Derudover leveres protokoller, her kan være let tilpasses til at undersøge virkningerne af andre EDC fasen spredning af embryogenese. Men for at studere sent vorden, protokollen vil kræve afgørende ændringer til vinduet kritisk tidspunkt udvikling under fokus. Desuden vil vores protokol ikke være egnet til eksperimenter der kræver længere perioder med giftstof eksponering, da det åbner mulighed for alternative udvikling pathway resulterer i langlivede dauer anholdelse på den anden molting cyklus, som er resistente til barske betingelser20. Yderligere ændringer og forbedringer vil være behov for længere eksponeringstider gennem supplement med en fødekilde, der ikke har potentiale til at metabolisere giftstoffet eller EDC fx autoklaveres E. coli. Afslutningsvis, vores metodologi kan udnyttes til at vurdere virkningerne af forskellige hormonforstyrrende kemikalier på frugtbarheden og neuronal funktion i ordningen hvirvelløse model C. elegans.

Udsættelse for miljøområdet giftstoffer, forbindelser især dem, der har tendens til at blande sig med udvikling, har været under grundig videnskabelig undersøgelse i de seneste år. Mere end 1000 kemikalier i daglig brug er klassificeret som hormonforstyrrende stoffer (EDC)1. Perioder med hurtig vækst og udvikling, som omfatter embryonale, spædbarn og barndom faser, har konstateret for at være særligt sårbare over for de skadelige virkninger for selv lav-dosis EDC. Deres virkning har vist sig at forårsage reproduktive og Neuro-udviklingsmæssige forstyrrelser2. Per retningslinjerne US Environmental Protection Agency og os nationale toksikologi Program panelet kan en lav dosis defineres som enhver dosis under niveauet for en, der er blevet rapporteret at forårsage en observerbar biologiske forandringer eller skader3. Udover lav-dosis virkninger af enkelte EDC har blandinger af forskellige EDC fundet ved lave koncentrationer i miljøet potentiale til at forårsage væsentlige kumulative virkninger4.
Bisphenol A (BPA eller 4,4'-(propane-2,2-diyl)) er en polymerizing agent findes i almindeligt brugte elementer som vand flasker, butik kvitteringer, dental fugemasser og foringer af drikkevarer og fødevarer dåser5. På grund af sin strukturelle lighed med 17-β Estradiol (E2) og sin affinitet til ERα og ERβ østrogenreceptorer, er BPA blevet klassificeret som en hormonforstyrrende kemiske (EDC)5,6. Selvom svagere, har BPAS affinitet til østrogen-receptorer vist sig at påvirke reproduktion system af begge køn og forstyrre neurale funktioner ved doser, der anses for sikkert7,8. For at forårsage langsigtede neuronal defekter i mus udsat for BPA9observeret ændringer i DNA methylering via epigenetically regulerede mekanismer. Specifikt, har BPA også været impliceret som en mulig synder for større procentdel af hyperaktivitet, opmærksomhed mangel og øget følsomhed over for narkotika på grund af en stigning set i D1 dopamin receptorer i mus limbiske forhjernen efter kronisk eksponering 9 , 10. væsentlige beviser om EDC skadelige virkninger på menneskers sundhed er baseret på korrelation undersøgelser fokuserer hovedsageligt på kronisk eksponering af befolkningen til miljømæssige giftstoffer selv ved lave doser5; dog er begrænsninger i slutninger fra humane undersøgelser og manipulere eksperimentelle kontrolelementer blevet accepteret at løse kritik af udokumenterede hype11,12.
På grund af bevarelsen af Caenorhabditis elegans' gener med hensyn til pattedyr, herunder dens steroid hormon-receptor gener, forskere har udnyttet denne genetisk tractable lab model for at optrævle de funktionelle og mekanistiske virkninger af EDC 13. eksperimenter med C. elegans har vist, at disse stoffer som BPA og BPS kan forårsage apoptose, embryonale dødelighed, forstyrrelser i dobbelt-strenget DNA pause reparation mekanismer og neurale funktion14,15 ,16.
Vores lab har tidligere vist, at selv lavdosis udsættelse begrænset til tidlige embryogenese fører til nedsat fertilitet med adfærdsmæssige underskud i de overlevende voksne15. Tilvænning til en gentagen stimulus er en form for associative læring i modelsystemer, herunder C. elegans, og vores metode bruger denne form for associative læring som en adfærdsmæssige output til assay de langsigtede virkninger af embryonale eksponering for giftige stoffer17 specifikt, vi leverer detaljerede protokoller for at studere BPA eksponering på C. elegans, herunder dens umiddelbare virkninger på embryonale dødelighed og langsigtede virkninger på voksen adfærd, med en samlet skematisk afbildet i Figur 1. Repræsentative resultater fra frugtbarhed og associative læring assays er forudsat for at fremhæve effektiviteten af vores metodologi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Uvæsentligt, såsom bisphenol A (BPA) og bisphenol S (BPS) polymeriserende agenter almindeligt anvendt i produktion af plast og talrige hverdagens brug produkter. Baseret på deres kemiske struktur og østradiol-lignende biologiske egenskaber, er de blevet klassificeret som hormonforstyrrende stoffer (EDC). Langvarig eksponering for EDC, selv ved lave doser, har været knyttet til forskellige sundhed defekter, herunder kræft, adfærdsmæssige forstyrrelser og barnløshed, med større sårbarhed angivet i tidlige udviklingsmæssige perioder. Cellulære og molekylære undersøgelser med genetisk tractable ødelægge model Caenorhabditis elegans har vist, at udsættelse for BPA forårsager apoptose, embryonale dødelighed og forstyrrelser i DNA reparation mekanismer. Vi har tidligere rapporteret at eksponering af C. elegans embryoner til lave doser af forskellige uvæsentligt nedsætter frugtbarhed. Derudover har vi vist at virkninger af eksponering i de meget tidlige stadier af udvikling persistere ind i voksenalderen, som analyseres af kvantificere tilvænning adfærd, en form for associative læring. Her, leverer vi detaljerede protokoller for embryonale eksponering for lav-dosis EDC samt de tilknyttede frugtbarhed og anterior touch tilvænning assays, sammen med repræsentative resultater.

Tidligere undersøgelser med C. elegans har rapporteret, at kontinuerlig eksponering for høje BPA koncentrationer (≥ 1 mM) i hele embryo udvikling og voksenliv nedsætter frugtbarhed14. Efterfølgende undersøgelser rapporteret fra vores lab har vist, at embryoner, der har været udsat for BPA i en begrænset periode på 4 h i begyndelsen faser af deres udvikling viste et fald i antallet af levedygtige æg lagt som voksne15 (figur 2). To vigtige elementer i metoden, der var, at a BPA koncentrationerne anvendes lå betydeligt lavere (0,1 µM til 10 µM range) og (ii) eksponering var begrænset til den tidlige embryonale periode. Udover nedsat frugtbarhed selv ved lavere doser viste vores tilvænning assays, orme udsat for BPA som embryoer krævede flere stimuli til blive vænnes sammenlignet med orme udsættes for køretøjet alene15 (figur 3). Disse effekter er bemærkelsesværdige, idet de er baseret på lav-dosis BPA eksponering, efter rationalet at mere subtile effekter på neuronal funktion, der ikke kan morfologisk tilsyneladende er tilbøjelige til at være mærkbar gennem adfærdsændringer. Kort sagt, præsenteret de repræsentative resultater her understregningstegn det faktum, at de skadelige effekter af BPA eksponering til et embryo påvirker dens udvikling, herunder neuronal funktion, der kan vurderes gennem voksen adfærdsmæssige assays i C. elegans. Protokoller findes her kan bruges til at teste lav-dosis samt langsigtede virkninger af andre potentielt giftige stoffer, herunder endokrine forstyrrende forbindelser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Figur 1: skematisk fremstilling af den eksperimentelle design. Voksne orm blev indsamlet og udsat for hypokloritiske løsning for at indsamle synkroniserede embryoner. Embryoner blev derefter udsat for BPA i forskellige koncentrationer til 4 h. De udsatte embryoner blev overført på seedede NGM plader, hvor de fik lov til at vokse i 60 timer ved 20 ° C. For at teste effektiviteten af eksponering i de tidlige faser af udvikling, L4 orme blev overført til enkelte plader og testet for frugtbarhed, og unge voksne blev testet med forreste touch tilvænning. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Figur 2: frugtbarhed er sænket med BPA. Eksponering for 1 µM og højere koncentrationer af BPA faldt betydeligt antal æg lagt i forhold til kontrol (repræsenteret af de vandret linje; n = 10, *p < 0,05). Fejllinjer betegne SEM. analyse udført ved hjælp af ANOVA, Tukey's post hoc test. Dette tal er blevet ændret fra Mariannes et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Figur 3: langsigtede effekter af embryonale BPA eksponering afspejles i voksen adfærd. Embryoner udsat for BPA koncentrationer så lav som 0,1 µM påvirker ikke-associative forreste touch tilvænning hos voksne (n = 60, *p < 0,05). Fejllinjer betegne SEM; ANOVA, Tukey's post hoc test. Dette tal er blevet ændret fra Mariannes et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Eksponering for miljømæssige giftige stoffer kan akut påvirke udviklingen med langsigtede virkninger. Detaljerede protokoller leveres til at illustrere en strategi ved hjælp af en effektiv lab model til at studere effekten af tidlig embryonale udsættelse for bisphenol A. Vi leverer frugtbarhed og adfærdsmæssige assays til at overvåge effektiviteten af vores giftstof eksponering bio-assays.

Langsigtede adfærdsmæssige og reproduktiv konsekvenser af embryonale eksponering for lav-dosis giftige stoffer

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur og Co-kultur Mouse æggestokke og ovariefollikler

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Vurdering af endotelcellemigration Efter eksponering for giftige kemikalier

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Brug<em&gt; Ex vivo</em&gt; Upright dråbedistribution Kulturer af Whole Fetal organer til at studere udviklingsprocesser under Mus Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering<em&gt; In-vivo</em&gt; Produceret Bovine præimplantationsembryoner Brug To farve Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En neddykket Filter Paper Sandwich til Langsigtet<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging af Early Chick embryoner

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Et alsidigt Montering Metode til Long Term Imaging af zebrafisk Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En simpel afdeling til langvarig konfokal billeddannelse af rod- og hypokotyludvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langsigtet Live-Imaging af<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Samling af efter parring sæd fra den kvindelige forplantningsorganerne og målingen af sæd fortætning i mus

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En In Vivo -metode til at studere mus blod-Testis barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...