Name: long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Ondersteuning door NSF (EPSCoR EPS-0814251) en NIH (1P20GM103653-01A1) MKT en HSD, Delaware State University's institutionele studiebegeleiding MDM (titel III HBGI) en KRS (NIH-INBRE) dankbaar is erkend. Dankzij het C. elegans genetische Center (ondersteund door NIH kantoor van onderzoek infrastructuur programma's P40 OD010110) for C. elegans wild-type N2 stam.

Protocollen die hieronder wordt gegeven om te testen van de effecten van BPA blootstelling tijdens de vroege embryogenese zijn gestandaardiseerd, en kunnen worden aangepast voor gebruik met BPS, BPF of andere EDCs en toxische stoffen op C. elegans embryo's.
1. materiële Setup
<ol><li>500 mL Nematode groei Media (NGM)18 media voor te bereiden door het oplossen van 1.5 g van NaCl, 1,25 g pepton en 8,5 g agar in water tot 500 mL. Na autoclaaf (15 PSI, 121 ° C, 20 min), Voeg 0,5 mL cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 0,5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL 1 M CaCl2 en 12,5 mL 1 M kalium fosfaatbuffer, pH 7.4 (108.3 g van KH2PO4 35.6 g K2HPO4, 1 L water).</li>
	<li>Bereid hypochlorietoplossing door het mengen van 25 mL 1 N KOH, 4 mL bleekwater en 71 mL water. Controleer deze oplossing vers.</li>
	<li>Bereid M9 Buffer door het mengen van KH2PO43 g 6 g nb2HPO4, 5 g NaCl, 5 mL 1 M MgSO4, en water toe 1 L.</li>
	<li>Bereid S Buffer18 door het mengen van 129 mL van 0,02 M K2HPO4, KH2PO4871 aantal milliliters en 5.85 g NaCl.</li>
	<li>M9 en S buffers in autoclaaf steriliseren.</li>
	<li>Groeien een overnachting cultuur van Escherichia coli (OP 50-stam) in 20 mL van de bouillon van de Luria (LB).</li>
	<li>Ontbinden BPA in 10% ethanol te maken van een stamoplossing van 1 mM. Maak de volgende verdunningen van 0.1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM en 10 µM in S buffer. Opmerking: Verdunning in de waterige S buffer sterk vermindert de concentratie van ethanol; bijvoorbeeld, met de hoogste BPA concentratie teststof beschreven in dit protocol (10 µM), is de concentratie van ethanol 0,1% v/v.</li>
</ol>2. C. elegans Culturing en synchronisatie
<ol><li>Giet de NGM media in 100 mm platen (ongeveer 25 mL/plaat) en laat het stollen. Eenmaal gestold, zaad de platen door het verspreiden van 150 µL van E. coli OP50 uit de vloeibare cultuur geteeld 's nachts. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>De volgende dag, overbrengen N2 wormen op de nieuwe platen met een geschatte plaat van 1 cm vierkant chunking. Wormen groeien gedurende 3 dagen bij 20 ° C, totdat de plaat is gevuld met goed gevoed volwassen volwassenen met zichtbare embryo's toestaan.</li>
	<li>Als u wilt synchroniseren, wassen elke plaat door pipetteren tot 5 mL van de M9 buffer over de plaat. De vloeistof overbrengen in een steriele 15 mL conische centrifugebuis. Opmerking: Synchronisatie is gedaan om te doden van de volwassen wormen en verzamelen van de embryo's die relatief hetzelfde stadium zijn.</li>
	<li>Centrifugeer bij 3000 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur met het oog op een losse pellet van volwassen wormen.</li>
	<li>Met behulp van een pipet 10 mL, verwijder voorzichtig het supernatant teneinde de pellet intact laten. Voeg 5 mL van de hypochlorietoplossing en meng voorzichtig.</li>
	<li>Centrifugeer bij 3000 x g bij kamertemperatuur gedurende 4 minuten.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet 10 mL en wassen met 7 mL M9 buffer. Herhaal deze stap tweemaal.</li>
</ol>3. wormen aan BPA bloot
<ol><li>Na de laatste wassen van stap 2.7 hierboven, ongeveer 100 µL van de eieren met de M9 buffer op te schorten. Breng ongeveer 50 µL van eieren 2 mL microfuge buizen al met de juiste concentratie die BPA verdund in S buffer. Pas de hoeveelheid S-buffer om ervoor te zorgen de juiste eindconcentratie van BPA (0,0 µM, 0.1 µM, 0,5 µM, 1.0 µM, 5.0 µM en 10 µM) per buis. Tabel 1 toont één manier om deze verdunningen.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Voor definitieve BPA concentratie</td>
			<td>Voorraad BPA (100 μM)</td>
			<td>S Buffer</td>
			<td>Gesynchroniseerde wormen</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>850 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Voorraad BPA, S buffer en gesynchroniseerde wormen gebruikt voor het bereiken van de gewenste concentraties gebruikt voor onze studie.
<ol start="2"><li>Plaats van buizen op een shaker en zachtjes schud gedurende 4 uur bij 20° C, bij 25 rpm voor een rondschudapparaat of 25 kantelt/min voor een rockende shaker.</li>
	<li>Na 4 uur, plaats van buizen in buis houders en laat wormen te regelen.</li>
	<li>Vloeistof wordt weggeworpen en wormen overbrengen geplaatste platen (NGM platen met OP50 E. coli). Breng de vloeibare OP50 E. coli cultuur zoals in 1.5 en zaad van de platen zoals vermeld in punt 2.1.</li>
	<li>Laat de wormen groeien voor 60 h in 20 ° C. Onderzoeken platen elke dag voor besmetting. Verontreinigde NGM platen zijn meestal verkleurd en vergezeld van afzonderlijke kolonies. Selectievakje wormen onder de Microscoop voor overbevolking. Een gebrek aan OP50 E. coli gazon en geconcentreerde wormen in kleine puntjes betekenen overbevolking.</li>
</ol>4. anterior Touch gewenning Assay
<ol><li>Overdracht van ongeveer 10 gesynchroniseerde jonge volwassen wormen aan nieuwe unseeded NGM platen met behulp van een Brand-gesteriliseerde 30 G platina-draad halen. Wormen ongestoord voor 5 min te laten verlaten tijd om te acclimatiseren op de nieuwe plaat.</li>
	<li>Voor de gewenning reactie, gebruik een wenkbrauw haren gekoppeld aan het einde van een sateprikker of tandenstoker en steriliseren door dompelen in 70% ethanol. Veeg met een schone stofvrije tissue en wacht 1 minuut voor ethanol te verdampen uit. Zachtjes aanraken van de worm op het hoofd (anterior van de faryngaal lamp) met behulp van de wenkbrauw haren. Herhaal de hand, waardoor 10 s tussen raakt zodat de worm te herstellen.</li>
	<li>Blijven aanraken (waardoor 10 s interstimulus intervallen) totdat de worm niet langer wordt achterwaarts verplaatst. De worm heeft op dit moment gewend op de prikkel. Het registreren van het aantal raakt die nodig zijn voor de worm naar koeien.</li>
	<li>Analyseren van het verschil tussen de tarieven van de gemiddelde gewenning van de behandelde en onbehandelde controles met one-way ANOVA gevolgd door de Tukey post hoc test.</li>
</ol>5. worm Fecundity Assay
<ol><li>Individuele L3 wormen overbrengen in een frisse en geplaatste plaat met behulp van een platina pick. Zorg ervoor dat slechts één worm per plaat is geplaatst. Opmerking: na het larvale stadium van L3, wormen ontwikkelen in L4 larvale stadium en volwassenheid. Plukken ze vroeg is handig, omdat ze groot genoeg voor de overdracht van individuele dieren zijn terwijl ervoor te zorgen dat ze niet al geen eieren die anders zouden worden gemist in de telling hebben gelegd.</li>
	<li>De getallen van elke 12-24 h gelegde eieren tellen. Na het tellen, door de bovenliggende worm te overbrengen in een nieuwe plaat. Herhaal totdat de worm stopt legt eieren, gewoonlijk na 5 dagen wanneer bij 20 ° c geïncubeerd. Opmerking: gemiddeld, een wild type worm kan tot 300 eieren leggen; Dus, de bovenliggende overbrengen naar een nieuwe plaat dagelijks voorkomt dat overbevolking.</li>
	<li>Het verschil tussen het gemiddelde aantal eieren gelegd door de besturingselementen van het behandelde en onbehandelde met one-way ANOVA, gevolgd door de Tukey post hoc test te analyseren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij niets hebben te onthullen.

Fasen van snelle groei en ontwikkeling zoals embryogenese zijn bijzonder kwetsbaar zijn voor de nadelige gevolgen van verschillende hormoonontregelende stoffen, met inbegrip van BPA. Wij bieden gedetailleerde protocollen voor het bestuderen van de effecten van blootstelling aan BPA of andere toxische stoffen in het C. elegans -ongewervelde model, waarmee handig titratie van een aantal uiteenlopende concentraties te evalueren van het effect daarvan op de levensvatbaarheid van het embryo (Figuur 2) . Follow-up gedrags experimenten op overleven van volwassenen die zich ontwikkelen van embryo's werden blootgesteld aan lage doses van BPA zodat keuring langetermijneffecten op neuronale functie (Figuur 3). De centrale gedachte van dit document is bedoeld als gedetailleerde protocollen voor het blootstellen van embryo's voor diverse toxische stoffen tijdens de vroege embryogenese periode in het model van C. elegans ; het eerste venster van de 4 uur van de periode van de embryonale ontwikkeling 11,5 uur (bij 20 ° C) komt overeen met de periode van de proliferatie, die wordt gevolgd door organogenese. Voor dit doel, hebben wij de validatie van de eindpunten via vruchtbaarheid en non-associative learning vitrotests verstrekt. Terwijl de mechanistische basis van het optreden van BPA en andere Bisfenol de Heilige Graal waarnaar onderzoek op dit gebied is gericht is, hebben we geen poging te bieden een mechanistische verklaring voor het optreden van BPA in deze methodiek gerichte artikel. Wij wil er echter op wijzen dat het C. elegans -model een ideaal systeem biedt om verder het ontleden van het werkingsmechanisme. Bijvoorbeeld, in de toekomst werken aan het ontcijferen van de mechanismen van BPA actie, C. elegans mutanten kunnen worden gegenereerd en gescreend voor een weerstand tegen de effecten van BPA en aldus de weg vrijmaken voor het ontcijferen van het traject. Daarnaast gaat onze metgezel papier met het effect van BPA op het niveau van de synchrony neuraal netwerk in gewervelde dieren, die een andere weg om te begrijpen van de basis voor het onderzoeken van mogelijke mechanismen die tot toxische effecten19.
In de methodologie beschreven in dit document, uitgevoerd sommige van de cruciale stappen die moeten extra zorgvuldig omvatten het volgende: het kiezen van een plaat met weldoorvoede C. elegans volwassenen met volwassen eieren zichtbaar onder de Microscoop dissectie is cruciaal, en bij gebreke aan deze stap zal resulteren in een onvoldoende steekproefgrootte van embryo's voor het EDC blootstelling experiment. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de hypochlorietoplossing vers om te voorkomen dat het verkrijgen van een niet-gesynchroniseerde bevolking die met de mogelijkheid interfereren zal voor het uitvoeren van BPA blootstelling tijdens de vroege embryogenese wordt gemaakt. Pellets met M9 wassen (na hypochloriet blootstelling) is ook een zeer belangrijke stap. Als het niet goed gedaan, de hoge concentratie van het bleekmiddel kan leiden tot dode embryo's. Bovendien moeten embryo's worden overgedragen aan geplaatste NGM platen na 4 uur. Als links in de BPA-oplossing voor een langere periode van tijd, van de embryo's kunnen uitgroeien tot de larven langlevende duur. Dit aanzienlijk verstoort vruchtbaarheid assay zowel gedrags testen. Als een van deze stappen wordt gemist, is het raadzaam om te beginnen met de procedure vanaf het allereerste begin. Als om welke reden, de NGM plaat met wormen besmet is of niet genoeg voedsel heeft, zal het stress op de wormen waardoor het scheeftrekken van de verzamelde gegevens toevoegen. Dergelijke platen moeten worden weggegooid en niet worden gebruikt in het experiment.
Eerder, een opmerkelijke studie met succes gebruikt het model van C. elegans om aan te tonen dat chromosoom afwijkingen door BPA resultaat als gevolg van de verdeling van DNA repair machines in de kiemcellen14 veroorzaakt. Het is echter opmerkelijk dat de bovenstaande studie ontwerp continu BPA Gasbedwelming met behulp van C. elegans hoge doses van BPA tijdens zijn levensduur had gebruikt. Onze methodologie werd ontworpen om te bestuderen van lage doses van BPA blootstelling tijdens de vroege embryogenese, teneinde de gehaltebepaling van de effecten op de embryonale levensvatbaarheid en subtieler langetermijneffecten op de overlevenden. Om onze kennis, is geen methode ontwikkeld om bloot vroege fase embryo's aan zeer lage doses van BPA beperkt tot een bepaalde periode; Dus, waardoor de methode hier gepresenteerd roman.
Bovendien voorzien de protocollen hier kan gemakkelijk aangepast worden aan het bestuderen van de effecten van andere EDCs tijdens de fase van de proliferatie van embryogenese. Echter om late embryonale stadia te bestuderen, worden het protocol moet belangrijke wijzigingen in het kritieke tijd venster van ontwikkelingen die zich onder de aandacht. Bovendien zal ons protocol niet geschikt zijn voor experimenten waarbij langere tijden van toxische blootstelling, aangezien het opent de mogelijkheid van het ontwikkelingstraject van de alternatieve wat resulteert in de arrestatie van langlevende duur op de tweede Rui cyclus, die bestand is tegen barre omstandigheden20. Verdere aanpassingen en verfijningen nodig zal zijn voor langere belichtingstijden via supplement met een bron van voedsel, dat geen mogelijkheden heeft om metaboliseren het veroorzaken of EDC bv gesteriliseerde met autoclaaf E. coli. Kortom, onze methodologie kan worden gebruikt om te beoordelen van de gevolgen van verschillende hormoonontregelaars op de vruchtbaarheid en neuronale functie in het modelsysteem-ongewervelde C. elegans.

Blootstelling aan toxische stoffen in het milieu, stoffen met name die de neiging om zich te mengen met ontwikkeling, zorgvuldige wetenschappelijke onderzochte is geweest in de afgelopen jaren. Meer dan duizend chemische stoffen in dagelijks gebruik worden geclassificeerd als hormoonontregelende stoffen (EDC)1. Perioden van snelle groei en ontwikkeling, waaronder embryonale, kind en jeugd stadia, hebben opgemerkt als bijzonder kwetsbaar zijn voor de schadelijke effecten te zelfs lage dosis EDC. Hun effect is aangetoond dat reproductieve en neurologische stoornissen2veroorzaken. Per de ons Environmental Protection Agency en het Amerikaanse nationale toxicologie Program deelvenster richtsnoeren, kan een lage dosis worden gedefinieerd als een dosis onder het niveau van een dat is gemeld veroorzaakt een waarneembare biologische verandering of schade3. Naast de effecten van de lage dosis van individuele EDCs kunnen mengsels van verschillende EDCs gevonden bij lage concentraties in het milieu veroorzaken materiële cumulatieve effecten4.
Bisphenol A (BPA of 4,4'-(propane-2,2-diyl)) is een polymerizing agent gevonden in veelgebruikte objecten zoals flessen water, winkel ontvangsten, tandheelkundige mastieken en de voeringen van drank en voedsel blikjes5. Als gevolg van de structurele gelijkenis met 17-β Estradiol (E2) en haar affiniteit met de ERα en ERβ oestrogeen receptoren, is BPA geclassificeerd als een hormoonontregelende chemische (EDC)5,6. Hoewel zwakker, is BPA van affiniteit aan oestrogeen receptoren aangetoond dat invloed op de reproductiesysteem van beide geslachten en neurale functies bij toepassing van doses die worden beschouwd als veilige7,8te verstoren. Wijzigingen in de methylation van DNA via epigenetically gereglementeerde mechanismen zijn waargenomen te veroorzaken op lange termijn neuronale gebreken in muizen blootgesteld aan BPA9. Specifiek, heeft BPA ook betrokken als een mogelijke dader voor verhoogde tarieven van hyperactiviteit, aandacht tekort en verhoogde gevoeligheid voor medicijnen als gevolg van een toename gezien in D1 dopamine receptoren in de muis limbische reukkolf na chronische blootstelling 9 , 10. significante aanwijzingen over de schadelijke gevolgen van EDCs op de menselijke gezondheid is gebaseerd op correlatie studies richt zich vooral op de chronische blootstelling van de bevolking voor toxische stoffen in het milieu zelfs op lage doses5; echter zijn beperkingen in gevolgtrekkingen uit menselijke studies en experimentele besturingselementen manipuleren aanvaard terwijl het aanpakken van de kritiek van ongefundeerde hype11,12.
Wijten aan de instandhouding van Caenorhabditis elegans genen met betrekking tot de zoogdieren, waaronder de steroïde hormoon-receptor genen, onderzoekers deze genetisch hanteerbare lab-model om te ontrafelen van de functionele en mechanistische effecten van EDCs hebben gebruikt 13. experimenten met C. elegans hebben aangetoond dat deze stoffen zoals BPA en BPS apoptosis, embryonale letaliteit, verstoring in de double-stranded DNA pauze herstelmechanismes en neurale functie14,15 veroorzaken kunnen ,16.
Onze lab heeft eerder aangetoond dat zelfs lage dosis blootstelling beperkt tot vroege embryogenese tot verminderde vruchtbaarheid met gedrags tekorten in de overlevende volwassenen15 leidt. Gewenning op een herhaalde prikkel is een vorm van non-associative learning in modelsystemen, met inbegrip van C. elegans, en onze methodologie maakt gebruik van deze vorm van non-associative leren als een gedrags uitgang te assay de langetermijneffecten van embryonale blootstelling aan de toxische stoffen17 specifiek, wij bieden gedetailleerde protocollen voor het bestuderen van BPA blootstelling op C. elegans, met inbegrip van de onmiddellijke gevolgen ervan voor embryonale letaliteit en langetermijneffecten op volwassen gedrag, met een totale schematische voorstelling afgebeeld in Figuur 1. Representatieve resultaten van vruchtbaarheid en non-associative learning vitrotests worden verstrekt aan het markeren van de doeltreffendheid van onze methodologie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisfenol, zoals Bisfenol A (BPA) en Bisfenol S (BPS) zijn actinemonomeren agenten op grote schaal gebruikt in de productie van plastics en talrijke producten voor dagelijks gebruik. Op basis van hun chemische structuur en estradiol-achtige biologische eigenschappen, zij aangemerkt als hormoonontregelende stoffen (EDC). Langdurige blootstelling aan EDCs, zelfs op lage doses, is gekoppeld aan verschillende gezondheid defecten met inbegrip van kanker, gedragsstoornissen en onvruchtbaarheid, met grotere kwetsbaarheid aangegeven perioden van vroege ontwikkelingsstoornissen. Cellulaire en moleculaire studies met het genetisch hanteerbare nematode model Caenorhabditis elegans hebben aangetoond dat blootstelling aan BPA veroorzaakt apoptosis, embryonale letaliteit en ontwrichting in het DNA herstelmechanismen. Eerder hebben we dat de blootstelling van C. elegans embryo's gemeld aan lage doses van verschillende Bisfenol dalingen vruchtbaarheid. Bovendien hebben we aangetoond dat de effecten van blootstelling tijdens het zeer vroege stadia van ontwikkeling in de volwassenheid, aanhouden zoals bepaald door het kwantificeren van gewenning gedrag, een vorm van non-associative learning. Hier, bieden wij gedetailleerde protocollen voor embryonale blootstelling aan lage dosis EDCs alsmede de bijbehorende vruchtbaarheid en anterior touch gewenning testen, samen met representatieve resultaten.

Eerdere studies met C. elegans hebben gemeld dat voortdurende blootstelling aan hoge concentraties BPA (≥1 mM) in de gehele embryo-ontwikkeling en volwassenheid fecundity14afneemt. Latere studies gerapporteerd uit ons lab hebben aangetoond dat embryo's die zijn blootgesteld aan BPA gedurende een beperkte periode van 4 uur in het begin stadia van hun ontwikkeling sprake van een daling in het aantal levensvatbare eieren gelegd als volwassenen15 (Figuur 2). Twee belangrijke kenmerken van de methodologie waren dat (i) de gebruikte concentraties van BPA aanzienlijk lager (0.1 µM tot 10 µM bereik) en (ii) de blootstelling was beperkt tot de vroege embryonale periode. Naast de verminderde vruchtbaarheid zelfs bij lagere doses bleek onze gewenning testen dat wormen blootgesteld aan BPA als embryo's meer prikkels vereist aan gewend geworden in vergelijking met wormen blootgesteld aan voertuig alleen15 (Figuur 3). Deze effecten zijn opmerkelijk, omdat ze zijn gebaseerd op lage dosis BPA blootstelling, na de grondgedachte dat subtielere effecten op neuronale functie die niet altijd duidelijk is morfologisch dreigen te worden onderscheiden door gedragsveranderingen. Kortom, de representatieve resultaten gepresenteerd hier onderstrepingsteken het feit dat de nadelige effecten van BPA blootstelling aan een embryo van invloed op de ontwikkeling ervan, met inbegrip van neuronale functie die kan worden beoordeeld door middel van volwassen gedrags testen in C. elegans. Protocollen die hier kunnen worden gebruikt voor het testen van de lage dosis, alsmede op de lange termijn effecten van andere potentiële toxische stoffen, met inbegrip van endocriene verstorende stoffen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Figuur 1: schematische weergave van de proefopzet. Volwassen wormen werden verzameld en blootgesteld aan hypochlorietoplossing om te verzamelen van gesynchroniseerde embryo's. De embryo's werden vervolgens blootgesteld aan verschillende concentraties van BPA voor 4 uur. De blootgestelde embryo's werden overgezet naar geplaatste NGM platen, waar zij werden toegestaan om te groeien gedurende 60 uur bij 20 ° C. Om te testen van de effectiviteit van blootstelling tijdens de vroege stadia van ontwikkeling, de L4 wormen werden overgedragen aan afzonderlijke platen en getest voor vruchtbaarheid, en jonge volwassenen werden getest met anterior touch gewenning. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Figuur 2: Fecundity is verlaagd door BPA. Blootstelling aan 1 µM en hogere concentraties van BPA aanzienlijk daalde het aantal eieren gelegd ten opzichte van het besturingselement (vertegenwoordigd door de horizontale lijn; n = 10, *p < 0,05). Foutbalken geven SEM. analyse gedaan met behulp van ANOVA, de Tukey post hoc test. Dit cijfer is gewijzigd van Mersha et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Figuur 3: lange termijn effecten van embryonale BPA blootstelling worden weerspiegeld in de volwassen gedrag. Embryo's die zijn blootgesteld aan BPA concentraties zo laag als 0,1 µM is van invloed op niet-associatieve anterior touch gewenning bij volwassenen (n = 60, *p < 0,05). Foutbalken geven SEM; ANOVA, de Tukey post hoc test. Dit cijfer is gewijzigd van Mersha et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Blootstelling aan toxische stoffen in het milieu kan acuut ontwikkeling met effecten op lange termijn beïnvloeden. Gedetailleerde protocollen worden geleverd om te illustreren een strategie met behulp van een effectieve lab-model om te bestuderen van het effect van vroege embryonale blootstelling aan Bisfenol A. Wij bieden vruchtbaarheid en gedrags tests om de doelmatigheid van onze toxische blootstelling bio-tests.

Gedrags- en reproductieve gevolgen van embryonale blootstelling aan toxische stoffen in lage dosis op lange termijn

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Cultuur en co-cultuur van de Muis eierstokken en ovariële follikels

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Beoordeling van endotheelcelmigratie na blootstelling aan giftige chemische stoffen

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profilering van<em&gt; In-Vivo</em&gt; Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo&#39;s met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Een Ondergedompeld Filter Paper Sandwich voor de lange termijn<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse beeldvorming van Early kippenembryo&#39;s

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Verzameling na paring sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem en de waardering van sperma vloeibaar in muizen

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Een In Vivo methode om te studeren muis bloed-Testis barrière integriteit

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...