Name: long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

תמיכה על ידי ה-NSF (EPSCoR EPS-0814251), NIH (1P20GM103653-01A1) MKT ו HSD, תמיכה מוסדיים סטודנט של אוניברסיטת מדינת דלאוור MDM (התואר השלישי HBGI), חברה (NIH-INBRE) הוא הודה בהכרת תודה. תודה למרכז C. elegans הגנטי (נתמך על-ידי Office NIH של מחקר תשתית תוכניות P40 OD010110) לזן N2 פראי-סוג C. elegans .

פרוטוקולים כדלקמן יש כבר סטנדרטית כדי לבחון את ההשפעה של חשיפה BPA במהלך המוקדמות מופרה, עשוי להיות שונה לשימוש עם BPS BPF או אחרים והריון, חשיפה לרעלים ב- C. elegans עוברי.
1. חומרים ההתקנה
<ol><li>להכין 500 מ"ל של מדיה צמיחה תולעים נימיות (NGM)18 מדיה על ידי המסת 1.5 גר' NaCl, g 1.25 של peptone ו- 8.5 גר' אגר במים עד 500 מ"ל. לאחר autoclaving (121 מעלות צלזיוס, 15 PSI, 20 דקות), להוסיף 0.5 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל אתנול), 0.5 מ של MgSO 1 מ'4, 0.5 מ של 1 מ' CaCl2 ו- 1 מ' אשלגן פוספט מאגר, pH 7.4 (g 108.3 של ח'2PO4 מ"ל 35.6 g K2HPO4, מים 1 ליטר).</li>
	<li>להכין פתרון תת-כלורי על ידי ערבוב 25 מ ל 1 N קו 4 מ"ל של אקונומיקה, 71 מ ל מים. להפוך פתרון זה טרי.</li>
	<li>הכנת מאגר M9 על ידי ערבוב דור 3 של2פו ח'4, 6 גר' נה2HPO4, 5 g של NaCl, 5 מ של 1 מ' MgSO4, עם המים כדי ל' 1</li>
	<li>להכין מאגר S18 על ידי ערבוב מ"ל 129 של 0.02 נקודות M K-2-HPO-4, 871 מ של ח'2PO4ו- g 5.85 של NaCl.</li>
	<li>לעקר את מאגרי M9 ו- S על-ידי autoclaving.</li>
	<li>לגדול תרבות לילה של Escherichia coli (OP 50 זן) ב- 20 מ של מרק לוריא (ליברות).</li>
	<li>להמיס BPA ב 10% אתנול לעשות פתרון מניות 1 מ מ. להפוך דילולים עוקבות של 0.1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר ו- 10 מיקרומטר במאגר S. הערה: דילול במאגר S מימית מקטינה באופן משמעותי את ריכוז האתנול; לדוגמה, הריכוז הגבוה ביותר BPA שמתואר פרוטוקול זה (10 מיקרומטר), הריכוז של אתנול הוא 0.1% v/v.</li>
</ol>2. C. elegans Culturing וסינכרון
<ol><li>שופכים את המדיה NGM לתוך צלחות 100 מ מ (כ-25 מ ל/צלחת) ולאפשר לחזק. ברגע פני השטח למוצק, זרע את הצלחות על ידי הפצת µL 150 של e. coli OP50 מתרבות נוזלי גדל בין לילה. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת, העברה N2 תולעים על גבי הלוחות החדשים על-ידי chunking של לוח משוער של 1 ס מ מרובע. לאפשר תולעים לצמוח למשך 3 ימים ב- 20 ° C עד הצלחת מאוכלסת מבוגרים מוזן היטב, המכיל עוברי גלוי.</li>
	<li>כדי לסנכרן, לשטוף כל צלחת על-ידי pipetting עד 5 מ של מאגר M9 על פני הלוח. להעביר את הנוזל שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15 מ"ל. הערה: סינכרון נעשית להשמדת תולעים בוגרות ולאסוף עוברי כי הם יחסית אותה במה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 3000 g x במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לקבל גלולה רופף של תולעים בוגרות.</li>
	<li>באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, הסר בזהירות את תגובת שיקוע כדי להשאיר את גלולה ללא פגע. הוסף 5 מ של הפתרון תת-כלורי ומערבבים בעדינות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 3000 g בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה 10 מ"ל, לשטוף עם mL 7 M9 המאגר. חזור על שלב זה פעמיים.</li>
</ol>3. חשיפת תולעים ל- BPA
<ol><li>לאחר לשטוף את האחרון מ שלב 2.7 לעיל, להשעות µL כ-100 ביצים עם מאגר M9. להעביר כ-50 µL ביצים microfuge 2 mL צינורות כבר המכיל הריכוז המתאים ש-BPA מדולל במאגר S. התאימו את כמות S-מאגר כדי להבטיח את הריכוז הסופי הנכון של BPA (מיקרומטר 0.0, 0.1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר, מיקרומטר 1.0, מיקרומטר 5.0 ו- 10 מיקרומטר) למחזור. טבלה 1 מדגים דרך אחת דילולים אלה.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ריכוז BPA הסופי</td>
			<td>במניה BPA (100 μM)</td>
			<td>מאגר S</td>
			<td>תולעים מסונכרן</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>850 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מניות BPA, מאגר S ותולעים מסונכרן המשמש להשגת ריכוז הרצוי משמש המחקר שלנו.
<ol start="2"><li>במקום צינורות על מטרף ומנערים בעדינות במשך 4 שעות ב- 20° C, סל ד 25 עבור מטרף רוטרי או מטה/דקה 25 עבור מטרף נדנדה.</li>
	<li>לאחר 4 שעות, מניחים צינורות מחזיקי צינור ולאפשר תולעים להתיישב.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע ולאחר להעביר תולעים ללוחות הזריעה (NGM צלחות עם OP50 e. coli). להפוך את התרבות OP50 e. coli נוזלי כאמור ב- 1.5, זרע את לוחיות הרישוי כאמור 2.1.</li>
	<li>תעזוב את התולעים גדלים עבור 60 h ב- 20 ° C. בדוק לוחות בכל יום עבור זיהום. צלחות NGM מזוהמים בדרך כלל דהוי, בליווי מושבות בודדות. בדיקת תולעים במיקרוסקופ לחיפוש צפיפות יתר. חוסר OP50 e. coli הדשא ותולעים מרוכזים מקומות קטנים מרמזים צפיפות יתר.</li>
</ol>4. הקדמי מגע Habituation Assay
<ol><li>העברת כ 10 מסונכרן הצעיר לאסוף תולעים בוגרות ללוחות חדש unseeded NGM באמצעות חוט פלטינה 30 G מחוטא-אש. להשאיר תולעים ללא הפרעה במשך 5 דקות כדי לאפשר להם זמן להתאקלם לצלחת חדשה.</li>
	<li>על התגובה habituation, להשתמש של שיער הגבות המצורפת לקצה של שיפוד עץ או קיסם, לעקר בטבילת 70% אתנול. לנגב עם טישו נקייה נטולת ולחכות 1 דקות עבור אתנול מתמוססות חופש. לגעת בעדינות את התולעת על הראש (קדמי של הנורה בלוע) באמצעות שיער הגבה. חזור על הנגיעות, ומאפשר 10 s בין נגיעות על מנת לאפשר את התולעת להתאושש.</li>
	<li>ממשיכים לגעת (המאפשר 10 s במרווחים interstimulus) עד התולעת כבר לא זז אחורנית. בשלב זה, התולעת יש בלתי כדי הגירוי. רשום את מספר נגיעות הדרושות התולעת habituate.</li>
	<li>לנתח את ההפרש בין שיעור habituation אכזרי של הפקדים טיפול ללא טיפול באמצעות חד-כיווני אנובה ואחריו מבחן לאחר הוק של Tukey.</li>
</ol>5. תולעת פוריות Assay
<ol><li>להעביר תולעים L3 בודדים צלחת הזריעה ורענן באמצעות איסוף פלטינה. ודא כי התולעת היחידה הזאת מניחים בכל צלחת. הערה: לאחר, הזחל L3, תולעים להתפתח L4 הפרפרים והעשים ובבגרות. נוח לקטוף אותם מוקדם כי הם גדולים מספיק להעברת חיות בודדות תוך הבטחת כי הם לא כבר הניחו ביצים אשר אחרת יהיו חסרים בספירה.</li>
	<li>לספור את המספרים של ביצים זיון בכל 12 – 24 h. לאחר ספירת, להעביר את התולעת האב צלחת חדשה. חזור עד התולעת מפסיקה הנחת ביצים, בדרך כלל אחרי 5 ימים כאשר מודגרות ב 20 º C. הערה: בממוצע, תולעת פראי סוג יכולה להטיל ביצים עד 300; לכן, העברת ההורה צלחת חדשה מדי יום מונע צפיפות יתר.</li>
	<li>לנתח את ההבדל בין המספר הממוצע של ביצים שמטילים את הפקדים טיפול ללא טיפול באמצעות חד-כיווני אנובה ואחריו מבחן לאחר הוק של Tukey.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם כלום לחשוף.

שלבי מהיר של גדילה והתפתחות כגון מופרה פגיעים במיוחד להשפעות מזיקות של תרכובות שונות שיבוש אנדוקרינית, כולל BPA. אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים ללמוד את ההשפעות של חשיפה BPA או אחרים חשיפה לרעלים במודל C. elegans הגעה, אשר מאפשר טיטור נוח של מגוון של ריכוזים כדי להעריך את השפעתו על העובר הכדאיות (איור 2) . מעקב ניסויים התנהגותיים על ששרד מבוגרים המתפתחים מ עוברי כי היו חשופים נמוך מינונים של BPA לאפשר assaying השפעות ארוכות טווח על תפקוד (איור 3). הרעיון המרכזי של המאמר נועד לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים חשיפת העוברים על חשיפה לרעלים שונים במהלך התקופה הקדומה מופרה בדגם C. elegans ; החלון 4 h הראשון של תקופת התפתחות שלו שעה 11.5 (ב- 20 ° C) מקביל תקופת ההתפשטות, שבעקבותיה באה organogenesis. למטרה זאת, סיפקנו אימות של נקודות הקצה דרך פוריות, מבחני הלא-associative learning. בעוד בסיס מכניסטית של הפעולה של BPA, bisphenols אחרים היא הגביע הקדוש כלפי אשר נועד המחקר בתחום זה, יש לנו לא לנסות להציע הסבר מכניסטית עבור הפעולה של BPA במאמר ממוקד מתודולוגיה. עם זאת, ברצוננו לציין כי המודל C. elegans מציע מערכת אידיאלית לנתח נוסף מנגנון הפעולה. לדוגמה, עבודה בעתיד בפענוח מנגנוני פעולה BPA, C. elegans מוטציות ניתן להפיק איבחון התנגדות ההשפעות של BPA, ובכך לסלול את הדרך עבור פענוח השביל. בנוסף, המאמר לוויה שלנו עוסק ההשפעה של BPA ברמה synchrony ביותר רשת עצבית באזור החוליות, מתן דרך חדשה להבין את הבסיס על חקירת מנגנוני פוטנציאל ההשפעות toxicant19.
בהמתודולוגיה מפורט בעיתון הזה, חלק מהשלבים הקריטיים שאמורים להיות מוצא להורג תוספת בקפידה כוללים את הפריטים הבאים: בחירת צלחת עם מוזן היטב C. elegans מבוגרים עם לעין תחת המיקרוסקופ לנתיחה בוגרת ביצים הוא קריטי, ו מאי-קיום של שלב זה יחול גודל המדגם לא מספיקות של העוברים לניסוי חשיפה EDC. חשוב גם לוודא כי הפתרון תת-כלורי מורכב טריים כדי להימנע מקבלת אוכלוסיה מסונכרן זה יפריע היכולת לבצע חשיפה BPA במהלך המוקדמות מופרה. נטילת כדורי עם M9 (לאחר חשיפה תת-כלורי), הוא גם צעד חשוב מאוד. אם לא נעשה כראוי, הריכוז הגבוה של אקונומיקה עלולה לגרום עוברי המת. בנוסף, העוברים יועבר ללוחות NGM הזריעה אחרי 4 שעות. אם נשאר בפתרון BPA לתקופה ממושכת של זמן, העוברים נוטים להתפתח הזחלים חיים ארוכים dauer. זה יפריע באופן משמעותי assay פוריות וגם מבחני התנהגות. אם כל אחד משלבים אלה הוא החמיץ, רצוי להתחיל את ההליך מההתחלה. אם מסיבה כלשהי, הצלחת NGM עם תולעים מזוהמים או אין מספיק אוכל, זה יוסיף לחץ על התולעים ובכך הטיית הנתונים שנאספו. צלחות כאלה צריכים להיות מושלך, לא תשמש את הניסוי.
בעבר, מחקר יוצא דופן משתמשים בהצלחה את מודל C. elegans להדגים כי ליקויים כרומוזום נגרמת על ידי תוצאה BPA עקב פירוק של ה-DNA תיקון מכונות ב germline14. עם זאת, ראוי לציין כי תכנון המחקר הנ ל השתמשו רציפה BPA חשיפה של C. elegans מינונים גבוהים של BPA לאורך כל תוחלת החיים שלה. המתודולוגיה שלנו תוכנן כדי ללמוד במינון נמוך של BPA חשיפה במהלך מופרה מוקדם, כדי assay שלה השפעות על הכדאיות עובריים ואת הקונטקט השפעות ארוכות טווח על הניצולים. לידע שלנו, פותחה המתודולוגיה אין לחשוף את העוברים בשלב מוקדם כדי מינון נמוך מאוד של BPA מוגבלת לתקופה שצוינה של זמן; לפיכך, שהופך את השיטה המוצגת כאן רומן.
בנוסף, פרוטוקולים מסופקים כאן ניתן להתאים בקלות לחקור את ההשפעות של אחרים והריון בשלב התפשטות של מופרה. עם זאת, ללימוד מאוחר העובריים, הפרוטוקול ידרוש המהותיים לחלון הזמן הקריטי של פיתוח תחת המוקד. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו לא יהיה מתאים לניסויים הדורשים פעמים יותר זמן של חשיפה toxicant, כמו זה פותח את האפשרות של מסלול חלופי פיתוח וכתוצאה מכך המעצר dauer חיים ארוכים-המחזור השני molting, אשר עמיד בתנאים קשים20. שינויים נוספים, ליטושים יהיה צורך משכי זמן ארוכים יותר חשיפה דרך תוספת עם מקור מזון שאינו בעל פוטנציאל כדי לעכל את toxicant או EDC למשל בלוק e. coli. לסיכום, המתודולוגיה שלנו יכול להיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעות של שונים משבשי על פוריות ועל תפקוד במערכת מודל הגעה C. elegans.

חשיפה חשיפה לרעלים סביבתיים, בעיקר תרכובות אלה נוטים להפריע פיתוח, היה תחת הדקדקניות המדעי בשנים האחרונות. יותר מאלף כימיקלים בשימוש יומיומי מסווגים משבשי תרכובות (EDC)1. כבר ציינו תקופות של צמיחה מהירה, הכוללים עובריים, תינוקות ופיתוח הילדות שלבים, להיות פגיעים במיוחד להשפעות מזיקות כדי EDC אפילו במינון נמוך. השפעתם הוכחו לגרום הפרעות של הרבייה, התפתחותיות-2. לפי ההנחיות לוח אותנו הסוכנות להגנת הסביבה של תוכנית הרעלים הלאומית אותנו, במינון נמוך עשוי להיות מוגדר בכל מינון מהרמה של אחד שדווחו כדי לגרום שינוי ביולוגי הנצפה או נזק3. מלבד ההשפעות במינון נמוך של הפרט והריון, תערובות של והריון שונים נמצאו בריכוזים נמוכים בסביבה יש פוטנציאל לגרום השפעות מצטברות מהותית4.
ביספנול A (BPA או 4,4'-(propane-2,2-diyl)) הוא סוכן polymerizing הנמצאים בשימוש נפוץ פריטים כגון בקבוקי מים, חנות קבלות, חומרי איטום שיניים הבטנה של משקאות, מזון פחיות5. בשל דמיון מבני שלה 17-β אסטרדיול (E2) שלו זיקה קולטני אסטרוגן ERα ו- ERβ, סווגה BPA כמו משבשי כימי (EDC)5,6. למרות החלשות, הזיקה של BPA קולטני אסטרוגן הוכח כדי להשפיע על מערכת רבייה של שני המינים, לשבש פונקציות עצביות במינונים נחשבים בטוחים7,8. שינויים מתילציה DNA באמצעות מנגנונים epigenetically מוסדרים נצפו כדי לגרום למומים עצביים לטווח ארוך בעכברים שנחשפו ל- BPA9. באופן ספציפי, BPA גם היה מעורב כמו הנאשם אפשרי עבור שיעור מוגבר של היפראקטיביות, חוסר תשומת לב ורגישות מוגברת לסמים עקב עלייה ראיתי D1 קולטני דופמין במוח הקדמי הלימבי העכבר לאחר חשיפה כרונית 9 , 10. עדויות משמעותיות על ההשפעות המזיקות של והריון על בריאות האדם מבוססת על מחקרים המתאם ומתמקדת בעיקר חשיפה כרונית של אוכלוסיות כדי חשיפה לרעלים סביבתיים בכלל במינון נמוך5; עם זאת, מגבלות מסקנות של מחקרים בבני אדם, מניפולציה ניסויית פקדים התקבלו תוך התייחסות הביקורת של ההייפ מבוססות11,12.
עקב השימור של גנים Caenorhabditis elegans' ביחס של יונקים, כולל את הגנים סטרואידים הורמון קולטן, חוקרים נעזרו מודל מעבדה גנטית צייתן זה לפענח את ההשפעות מכניסטית פונקציונלי של והריון 13. ניסויים עם C. elegans הראו כי אלה תרכובות כגון BPA, BPS יכול לגרום אפופטוזיס, lethality עובריים, הפרעה כפול גדילי DNA הפסקה תיקון מנגנוני תפקוד עצבי14,15 ,16.
המעבדה שלנו הראו בעבר כי במינון נמוך אפילו חשיפה מוגבלת מופרה מוקדם מוביל הנמכת פוריות עם חסרונות התנהגותיים מבוגרים ששרדו15. Habituation חוזרת ונשנית לגירוי היא צורה של הלא-associative learning במערכות דגם, כולל C. elegans, ומשתמש המתודולוגיה שלנו צורה זו של הלא-associative learning כפלט התנהגותית assay ההשפעות ארוכות הטווח של חשיפה עובריים חשיפה לרעלים17 באופן ספציפי, אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים ללמוד BPA חשיפה ב- C. elegans, לרבות השלכותיה מיידית על הקטלניות עובריים השפעות ארוכות טווח על התנהגות למבוגרים, עם מפרטים טכניים הכוללת מצטיירת איור 1. נציג תוצאות פוריות, אי-associative learning מבחני ניתנים כדי להדגיש את האפקטיביות של המתודולוגיה שלנו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisphenols, כגון ביספנול A (BPA) ו ביספנול S (BPS) הם polymerizing סוכנים שימוש נרחב בייצור של פלסטיק ומוצרים רבים לשימוש בכל יום. בהתבסס על המבנה הכימי שלהם תכונות ביולוגיות כמו אסטרדיול, הם שסווגו כמודעות משבשי תרכובות (EDC). חשיפה ארוכת טווח והריון, אפילו במינונים נמוכים, נקשר פגמים בריאות שונים, כולל סרטן, הפרעות התנהגות, בעיות פוריות, עם פגיעות רבה יותר המצוין במהלך תקופות התפתחותיות מוקדם. מחקרים תאית ומולקולרית עם המודל נמטודות גנטית צייתן Caenorhabditis elegans הראו כי החשיפה ל- BPA גורם אפופטוזיס, lethality עובריים, פגיעה ב- DNA תיקון מנגנונים. בעבר דיווחנו כי החשיפה של C. elegans העוברים למינונים נמוכים של פוריות ירידות bisphenols שונים. בנוסף, אנחנו הראו כי ההשפעות של חשיפה מאוד כבר בשלבים המוקדמים של פיתוח נמשכות לבגרות כמו לבדיקה על ידי לכימות habituation התנהגות, טופס של הלא-associative learning. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורט חשיפה עובריים והריון במינון נמוך כמו גם את פוריותה המשויך ו הקדמי לגעת מבחני habituation, יחד עם התוצאות נציג.

מחקרים מוקדמים יותר עם C. elegans דיווחו כי חשיפה מתמדת ריכוז BPA גבוה (≥1 מ"מ) במהלך התפתחות העובר ובבגרות פוחתת פוריות14. מחקרים מאוחרים יותר דיווח מהמעבדה שלנו הראו כי עוברי זה נחשפו ל- BPA לתקופה מוגבלת של 4 שעות בשלבים הראשונים של התפתחותם הראה ירידה במספר של ביציות פעילות סקס מבוגרים15 (איור 2). שתי תכונות חשובות של המתודולוגיה היו כי ריכוזי BPA (i) שימוש היו באופן משמעותי נמוך (0.1 מיקרומטר לטווח 10 מיקרומטר) ו- (ii) החשיפה הייתה מוגבלת עובריים התקופה הקדומה. מלבד פריון ירד אפילו במינון נמוך, מבחני habituation שלנו גילה כי תולעים נחשפים BPA כנדרש עוברי גירויים נוספים כדי להפוך בלתי בהשוואה תולעים חשופים לבד רכב15 (איור 3). תופעות אלה הן ראוי לציין כי הם מבוססים על חשיפה BPA במינון נמוך, בעקבות הרציונל כי השפעות עדינות יותר על תפקוד זה יכולה לא להיות גלויה מורפולוגית הם עשוי להיות ניכרת באמצעות שינויים התנהגותיים. בקיצור, התוצאות נציג המובאת כאן תחתון את העובדה כי השפעות מזיקות של BPA חשיפה העובר משפיעה על התפתחותו, כולל תפקוד זה ניתן לבדיקה באמצעות מבחני התנהגות למבוגרים C. elegans. פרוטוקולים שסופק כאן יכול לשמש לבדיקת השפעות אחרות חשיפה לרעלים פוטנציאליים כולל תרכובות משובש האנדוקרינית במינון נמוך, כמו גם לטווח ארוך.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של הנבחנים. תולעים בוגרות שנאספו ונחשף פתרון תת-כלורי כדי לאסוף עוברי מסונכרן. העוברים נחשפו ואז ריכוזים שונים של BPA במשך 4 שעות. העוברים חשופים הועברו על גבי לוחות NGM הזריעה, שבו הותר להם לגדול עבור 60 h ב- 20 ° C. כדי לבדוק את האפקטיביות של חשיפה כבר בשלבים המוקדמים של פיתוח, היו תולעים L4 הועבר לוחות בודדים והם עוברים בדיקות של פוריות, מבוגרים צעירים נבדקו עם המגע הקדמי habituation. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> איור 2: פוריות הוא הוריד ידי BPA. חשיפה 1 מיקרומטר ואת ריכוז גבוה של BPA ירד באופן משמעותי את מספר הביצים זיון בהשוואה הפקד (המיוצג על-ידי הקו האופקי; n = 10, *p < 0.05). קווי שגיאה מציינות ב- SEM. ניתוח נעשה באמצעות ANOVA, מבחן לאחר הוק של Tukey. איור זה השתנה מ. ואח ', 2015 Mersha15. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> איור 3: השפעות ארוכות טווח של חשיפה BPA עובריים באות לידי ביטוי בהתנהגות למבוגרים. העוברים חשופים BPA ריכוזי נמוך ככל מיקרומטר 0.1 משפיע על המגע הקדמי לשיוך habituation אצל מבוגרים (n = 60 *p < 0.05). קווי שגיאה מציינות SEM; אנובה, של Tukey פוסט הוק הבדיקה. איור זה השתנה מ. ואח ', 2015 Mersha15. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

חשיפה חשיפה לרעלים סביבתיים יכולים להשפיע בחריפות פיתוח עם השפעות ארוכות טווח. פרוטוקולים מפורט ניתנים כדי להמחיש אסטרטגיה באמצעות מודל מעבדה יעילה כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה מוקדמת עובריים ביספנול איי אנו מספקים פוריות, מבחני התנהגות לעקוב אחר האפקטיביות של הביו-מבחני שלנו החשיפה toxicant.

השלכות התנהגותיות, הרבייה לטווח ארוך של חשיפה עובריים חשיפה לרעלים במינון נמוך

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...