Name: long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Støtte av NSF (EPSCoR EPS-0814251) og NIH (1P20GM103653-01A1) MKT og "HSD", Delaware State Universitys institusjonelle student støtte til MDM (tittel III HBGI) og KRS (NIH-INBRE) er takknemlig anerkjent. Takk til C. elegans genetiske Center (støttet av NIH kontoret til forskning infrastruktur programmer P40 OD010110) for C. elegans vill-type N2 belastning.

Protokollene nedenfor har blitt standardisert for å teste effekten av BPA eksponering under tidlig embryogenesis og kan bli endret for bruk med BPS, BPF eller andre EDCs og giftstoffer på C. elegans embryoer.
1. materialet oppsett
<ol><li>Klargjør 500 mL Rundormer vekst medier (NGM)18 media ved oppløsning 1,5 g NaCl 1,25 g pepton og 8,5 g agar i 500 mL vann. Etter autoklavering (121 ° C, 15 PSI, 20 min), Legg til 0,5 mL av kolesterol (5 mg/mL i etanol), 0,5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL av 1 M CaCl2 og 12,5 mL 1 M kalium fosfatbuffer, pH 7.4 (108.3 g KH2PO4 35,6 g K2HPO4, vann til 1 L).</li>
	<li>Forberede hypokloritt løsning ved å blande 25 mL 1 N KOH, 4 mL av blekemiddel og 71 mL vann. Gjør denne løsning frisk.</li>
	<li>Forberede M9 Buffer ved å blande 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g av NaCl, 5 mL 1 M MgSO4og vann til 1 L.</li>
	<li>Forberede S Buffer18 ved å blande 129 mL 0.02 M K2HPO4, 871 mL KH2PO4og 5,85 g av NaCl.</li>
	<li>Sterilisere M9 og S buffere av autoklavering.</li>
	<li>Vokse en overnatting kultur av Escherichia coli (OP 50 belastning) i 20 mL av Luria kjøttkraft (LB).</li>
	<li>Løses BPA i 10% etanol å gjøre en 1 mM lagerløsning. Gjør etterfølgende fortynninger av 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM og 10 µM S buffer. Merk: Fortynning i vandig S bufferen reduserer konsentrasjonen av etanol; for eksempel på den høyeste BPA konsentrasjonen beskrevet i denne protokollen (10 µM), er konsentrasjonen av etanol 0,1% v/v.</li>
</ol>2. C. elegans Culturing og synkronisering
<ol><li>Hell NGM media i 100 mm plater (ca 25 mL/plate) og tillate det å stivne. Når styrket, frø platene ved å spre 150 µL av E. coli OP50 fra flytende kulturen vokst over natten. Inkuber plater på 37 ° C over natten.</li>
	<li>Neste dag, overføre N2 ormer på de nye platene ved chunking en omtrentlig skive av 1 cm i firkant. Tillate ormer å vokse i 3 dager på 20 ° C til platen fylles med velfødde eldre voksne som inneholder synlige embryoer.</li>
	<li>Hvis du vil synkronisere, vask hver plate av pipettering opptil 5 mL av M9 buffer over tallerkenen. Overføre væske til et sterilt 15 mL konisk sentrifuge rør. Merk: Synkronisering er gjort for å drepe voksen ormer og samle embryo som er relativt samme scene.</li>
	<li>Sentrifuge 3000 x g for 4 min ved romtemperatur for å få en løs pellet voksen ormer.</li>
	<li>Bruker en 10 mL pipette, forsiktig fjerne nedbryting for å forlate pellet intakt. Legg til 5 mL av hypokloritt løsningen og bland forsiktig.</li>
	<li>Sentrifuge 3000 x g ved romtemperatur i 4 minutter.</li>
	<li>Fjerne nedbryting med en 10 mL pipette og vask med 7 mL av M9 buffer. Gjenta dette trinnet to ganger.</li>
</ol>3. utsette ormer å BPA
<ol><li>Etter siste vask fra trinn 2.7 ovenfor, suspendere 100 µL av egg med M9 buffer. Overføre 50 µL av egg til 2 mL microfuge rør allerede inneholder riktig konsentrasjonen BPA fortynnet i S buffer. Justere S-buffer for å sikre riktig siste konsentrasjonen av BPA (0.0 µM, 0.1 µM, 0,5 µM, 1.0 µM, 5.0 µM og 10 µM) per rør. Tabell 1 viser én måte å lage disse fortynninger.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>For siste BPA konsentrasjon</td>
			<td>Lager BPA (100 μM)</td>
			<td>S Buffer</td>
			<td>Synkroniserte ormer</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>850 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Lager BPA, S buffer og synkronisert ormer brukes til å oppnå de ønskede konsentrasjonene brukes for vår studie.
<ol start="2"><li>Plassere rør på en shaker og rist forsiktig 4 h ved 20° C, på 25 rpm for en roterende shaker eller 25 vippes/min for en rocking shaker.</li>
	<li>Etter 4 h, plassere rør i rør holdere og tillate ormer å avgjøre.</li>
	<li>Forkast nedbryting og overføre ormer til seeded plater (NGM plater med OP50 E. coli). Gjør flytende OP50 E. coli kulturen som nevnt i 1.5 og frø platene som nevnt i 2.1.</li>
	<li>La ormer vokse for 60 h i 20 ° C. Undersøke plater hver dag for forurensning. Forurenset NGM platene er vanligvis misfarget og ledsaget av enkelte koloniene. Sjekk ormer under mikroskop for overbefolkning. Mangel på OP50 E. coli plenen og konsentrert ormer i små flekker betegne overbefolkning.</li>
</ol>4. fremre Touch habituering analysen
<ol><li>Overføre ca 10 synkronisert unge voksne ormene til nye unseeded NGM plater ved hjelp av en brann-steriliseres 30 G platina wire plukke. La ormer uforstyrret i 5 min å få tid til acclimatize til nye plate.</li>
	<li>Bruke en øyenbrynet hår festet til enden av en tre spyd eller tannpirker habituering svaret, og sterilisere av dipping i 70% etanol. Tørk med en ren lofri vev og vente 1 min for etanol fordampe av. Forsiktig ta ormen på hodet (anterior av pharyngeal pære) bruker øyenbrynet hår. Gjenta detaljer, slik at 10 s mellom detaljer slik at ormen å gjenopprette.</li>
	<li>Fortsett å røre (tillater 10 s interstimulus intervaller) til ormen ikke lenger flytter bakover. På dette punktet, har ormen habituated til stimulans. Registrere antall finpussen for ormen å venne.</li>
	<li>Analysere forskjellen mellom mener habituering utbredelsen av behandlet og ubehandlet kontrollene med enveis ANOVA etterfulgt av Tukey's post hoc-test.</li>
</ol>5. ormen fruktbarhet analysen
<ol><li>Overføre personlige L3 ormer til en frisk og frø plate med en platina hakke. Kontroller at bare én ormen er plassert per plate. Merk: etter L3 larvestadiet, ormer utvikle seg til L4 larvestadiet og voksen. Det er praktisk å plukke dem tidlig i at de er store nok for overføring av enkelte dyr samtidig at de ikke har allerede lagt noen egg som ellers ville bli savnet i tellingen.</li>
	<li>Tell hvor mange egg lagt hver 12-24 h. Etter å telle, overføre overordnede ormen til en ny plate. Gjenta til ormen slutter å legge egg, vanligvis etter 5 dager når ruges på 20 ° C. Merk: gjennomsnittlig vill type orm kan legge opp til 300 egg; Derfor forhindrer overføre overordnet til en ny plate daglig overbefolkning.</li>
	<li>Analysere forskjellen mellom gjennomsnittlig antall egg lagt av behandlet og ubehandlet kontrollene med enveis ANOVA etterfulgt av Tukey's post hoc-test.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.

Rask vekst og utvikling som embryogenesis er særlig sårbare for de skadelige virkningene av ulike endokrine-forstyrre forbindelser, herunder BPA. Vi gir detaljert protokoller for å studere virkningene av eksponering for BPA eller andre giftstoffer i C. elegans virvelløse modellen, som tillater praktisk titrering av en rekke konsentrasjoner å vurdere effekten på fosteret levedyktighet (figur 2) . Følge opp atferdsmessige eksperimenter gjenlevende voksne som utvikler fra embryo var utsatt for lave doser av BPA at assaying langtidseffekter neuronal funksjonen (Figur 3). Den sentrale ideen med denne utredningen er å gi detaljert protokoller for utsette embryo til ulike giftstoffer i tidlig embryogenesis perioden i C. elegans modellen; vinduet for første 4 h i sin 11,5 time embryonale utvikling (ved 20 ° C) tilsvarer spredning perioden, som er etterfulgt av organogenesen. Mot dette formål, har vi gitt validering av endepunktene gjennom fruktbarhet og associative læring analyser. Mens mekanistisk grunnlaget for handlingen av BPA og andre bisphenols er den hellige gralen forskning i dette feltet er rettet mot, har vi ikke forsøk på å tilby en mekanistisk forklaring for handlingen av BPA artikkelens metodikk fokusert. Imidlertid vil vi gjerne påpeke at C. elegans modellen tilbyr et ideelt system for å ytterligere analysere virkningsmekanismen. For eksempel, i fremtiden arbeid på å tyde virkningsmekanismer BPA, C. elegans mutanter kan genereres og vist for en motstand mot virkningene av BPA og dermed tilrettelegge for tyde veien. I tillegg omhandler våre følgesvenn papir effekten av BPA på nettverk synkronisering nivå i virveldyr, gir en annen vei å forstå grunnlaget for å undersøke mulige mekanismer for toxicant effekter19.
I metodikk beskrevet i dette dokumentet, kjøres noen av de viktige trinnene som bør være ekstra forsiktig inkluderer følgende: velge en plate med velfødde C. elegans voksne med moden eggeskall synlig under disseksjon mikroskopet er avgjørende, og unnlate å følge dette trinnet vil resultere i en utilstrekkelig utvalgsstørrelse av embryo for EDC eksponering eksperimentet. Det er også viktig å sørge for at den hypokloritt løsningen er laget frisk å unngå å få en usynkroniserte befolkning som vil påvirke muligheten til å utføre BPA eksponering under tidlig embryogenesis. Vaske pellets med M9 (etter hypokloritt eksponering) er også et svært viktig skritt. Hvis det ikke gjøres riktig, kan den høye konsentrasjonen av blekemiddel resultere i døde embryoer. I tillegg skal embryo overføres til seeded NGM plater etter 4 h. Hvis venstre i BPA løsningen for en lengre periode, er the embryo sannsynlig å utvikle i larvae varige dauer. Dette vil betydelig forstyrre både fruktbarhet analysen og atferdsmessige analyser. Hvis noen av disse trinnene er savnet, er det tilrådelig å starte prosedyren helt fra begynnelsen. Hvis for noe grunn, NGM platen med ormer er forurenset eller ikke har nok mat, øker stress på ormer og dermed forskyve de innsamlede dataene. Slike plater bør forkastes og brukes ikke i eksperimentet.
Tidligere brukt en bemerkelsesverdig studie C. elegans modellen for å demonstrere at kromosom unormalt forårsaket av BPA resultatet på grunn av sammenbrudd av DNA reparasjon maskiner i germline14. Men er det bemerkelsesverdig at ovennevnte studien design hadde brukt kontinuerlig BPA eksponering C. elegans høye doser av BPA gjennom hele dens levetid. Vår metode ble utviklet for å studere lave doser BPA eksponering under tidlig embryogenesis, slik at analysen dens effekter på embryonale levedyktighet og subtil langtidseffekter på overlevende. Til vår kunnskap, er ingen metode utviklet for å avdekke tidlig stadium embryo til svært lave doser av BPA begrenset til et angitt tidsrom; dermed presenteres gjør metoden her roman.
I tillegg gitt protokoller her kan lett tilpasses studere virkningene av andre EDCs i spredning fasen av embryogenesis. Men for å studere slutten embryonale stadier, vil protokollen kreve viktige endringer vinduet kritisk tid av utvikling under fokus. Videre vil våre protokollen ikke være egnet for eksperimenter krever lengre tid toxicant eksponering, som åpner opp muligheten for alternative utvikling veien som fører til lang levetid dauer arrestasjonen på andre molting syklusen, som er motstandsdyktig harde betingelser20. Ytterligere endringer og forbedringer vil være behov for lengre lukkertider gjennom supplement med en matkilde som ikke har potensial til å forbrenne toxicant eller EDC f.eks autoklaveres E. coli. Avslutningsvis vår metode kan brukes til å vurdere effekten av ulike endokrine forstyrre kjemikalier i fruktbarhet og neuronal funksjon i virvelløse modell systemet C. elegans.

Eksponering for miljømessige giftstoffer, forbindelser spesielt som pleier å forstyrre utvikling, har vært under forsiktig vitenskapelig undersøkelse de siste årene. Mer enn tusen kjemikalier i daglig bruk er klassifisert som endokrine forstyrre forbindelser (EDC)1. Perioder med rask vekst og utvikling, som inkluderer embryonale, spedbarn og barndommen stadier, har blitt notert til å være spesielt utsatt for skadelige effekter med lav dose EDC. Deres effekt har vist seg å forårsake reproduksjons- og neurodevelopmental lidelser2. Per oss Environmental Protection Agency og oss National toksikologi Program panelet retningslinjene, kan en lav dose defineres som en dose under nivået som er rapportert å forårsake en observerbar biologiske endringer eller skade3. Tillegg lavdose effekter av personlige EDCs har blandinger av ulike EDCs på lave konsentrasjoner i miljøet potensial til å forårsake materielle kumulative effekter4.
Bisphenol A (BPA eller 4,4'-(propane-2,2-diyl)) er en polymerizing agent i brukte elementer som vannflasker, lagre kvitteringer, tannlege Forseglinger og fôr av drikke og mat bokser5. Strukturelle likhet til 17-β østradiol (E2) og sin affinitet til de ERα og ERβ østrogen-reseptorene, er BPA klassifisert som en endokrine forstyrre kjemiske (EDC)5,6. Men svakere, har BPA affinitet til østrogen-reseptorer blitt vist å påvirke reproduksjon systemet av begge kjønn og forstyrre nevrale funksjoner ved doser som anses som trygge7,8. Endringer i DNA metylering via epigenetically regulert mekanismer er observert for å forårsake langsiktige neuronal feil i mus utsatt for BPA9. Spesielt har BPA også vært innblandet som en mulig gjerningsmann for økt forekomst av hyperaktivitet, oppmerksomhet mangel og økt følsomhet for narkotika skyldes en økning sett i D1 dopamin-reseptorer i musen limbiske forebrain etter kronisk eksponering 9 , 10. betydelige bevis på skadelige effekter av EDCs på menneskers helse er basert på sammenheng studier på kronisk eksponering av bestander å miljømessige giftstoffer selv ved lave doser5; men har begrensninger i slutninger fra menneskelige studier og manipulere eksperimentelle kontrollene blitt akseptert mens adressering kritikk av grunnløse sprøytenarkoman11,12.
Grunn av bevaring av Caenorhabditis elegans' gener forhold til pattedyr, inkludert sine steroid hormon-reseptor gener, forskere har benyttet denne genetisk medgjørlig lab-modellen for å avdekke de funksjonelle og mekanistisk effektene av EDCs 13. eksperimenter med C. elegans har vist at disse forbindelser som BPA og BPS kan forårsake apoptose, embryonale dødelighet, avbrudd i double-strandet DNA pause reparasjonsmekanismene og nevrale funksjonen14,15 ,16.
Våre lab har tidligere vist at selv lav dose eksponering begrenset til tidlig embryogenesis fører til redusert fruktbarhet med atferdsdata underskudd i overlevende voksne15. Habituering til en gjentatt stimulans er en form av ikke-associative læring i modellsystemer, inkludert C. elegans, og vår metode bruker dette skjemaet av ikke-associative læring som en opptreden utgang til analysen de langsiktige effektene av embryonale eksponering giftstoffer17 spesielt vi gir detaljert protokoller for å studere BPA eksponering på C. elegans, inkludert dens umiddelbar virkning på embryonale dødelighet og langsiktige virkninger på voksne atferd, med en samlet skjematisk avbildet i Figur 1. Representant resultater fra fruktbarhet og associative læring analyser er gitt til markere effektiviteten av vår metode.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisphenols, for eksempel bisfenol A (BPA) og bisfenol S (BPS) er polymerizing agenter som er mye brukt i produksjon av plast og mange daglig bruk produkter. Basert på kjemiske struktur og østradiol-lignende biologiske egenskaper, er de klassifisert som endokrine forstyrre forbindelser (EDC). Langvarig eksponering EDCs, selv ved lave doser, har vært knyttet til forskjellige sunnhet feilene som kreft, atferdsforstyrrelser og infertilitet, med større sårbarhet angitt i tidlig utviklingsmessige perioder. Cellulære og molekylære studier med genetisk medgjørlig Rundormer modell Caenorhabditis elegans har vist at eksponering for BPA forårsaker apoptose, embryonale dødelighet og avbrudd i DNA-reparasjon mekanismer. Vi har tidligere rapportert at eksponering av C. elegans embryo lave strålingsdoser forskjellige bisphenols nedgang fruktbarhet. I tillegg har vi vist at effekten av eksponering under de tidlige stadiene av utviklingen vedvare i voksen alder som assayed av kvantifisere habituering atferd, en form av ikke-associative læring. Her gir vi detaljerte protokoller for embryonale eksponering for lavdose EDCs samt den tilknyttede fruktbarhet og fremre touch habituering analyser, sammen med representant resultater.

Tidligere studier med C. elegans har rapportert at kontinuerlig eksponering for høye BPA konsentrasjoner (≥1 mM) gjennom embryo utvikling og voksen redusert fruktbarhet14. Påfølgende undersøkelser rapportert fra vår lab har vist at embryo som har vært utsatt for BPA for en begrenset periode av 4 h i begynnelsen stadier av deres utvikling viste en nedgang i antall levedyktig egg lagt som voksne15 (figur 2). To viktige funksjoner av metodikken var at (i) BPA konsentrasjoner brukes var betydelig lavere (0,1 µM for 10 µM) og (ii) eksponering var begrenset til den første embryonale perioden. I tillegg til redusert fruktbarhet selv ved lavere doser avslørte våre habituering analyser at ormer utsatt for BPA som embryo kreves mer stimuli å bli habituated sammenlignet med ormer utsatt for kjøretøy alene15 (Figur 3). Disse effektene er bemerkelsesverdig i at de er basert på lav dose BPA eksponering, etter begrunnelsen at subtil effekter på neuronal funksjon som ikke kanskje morphologically tilsynelatende er sannsynlig å være merkbar gjennom atferdsendringer. Kort sagt, representant resultatene presentert her understreker det faktum at de skadelige virkningene av BPA eksponering for et embryo påvirker utviklingen, inkludert neuronal funksjon som kan vurderes gjennom voksen atferdsmessige analyser i C. elegans. Protokollene her kan brukes for å teste lavdose samt langsiktige virkningene av andre potensielle giftstoffer inkludert endokrine forstyrrende forbindelser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk fremstilling av eksperimentell design. Eldre ormer var samlet og utsatt for hypokloritt løsning for å samle synkronisert embryoer. Embryoene ble deretter utsatt for ulike konsentrasjoner av BPA 4 h. De synlige embryoene ble overført på seeded NGM plater, hvor de ble tillatt å vokse for 60 h på 20 ° C. For å teste effektiviteten av eksponering under de tidlige stadiene av utviklingen, L4 ormer ble overført til individuelle tallerkener og testet for fruktbarhet, og unge voksne ble testet med fremre touch habituering. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Figur 2: fruktbarhet senkes ved BPA. Eksponering 1 µM og høyere konsentrasjoner av BPA betydelig redusert antall egg lagt sammenlignet med kontrollen (representert ved den vannrette linjen; n = 10 *p < 0,05). Feilfelt betegne SEM. analyse gjort med ANOVA, Tukey's post hoc-test. Dette tallet er endret fra Mersha et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Figur 3: langtidseffekter av embryonale BPA eksponering gjenspeiles i voksen atferd. Embryo utsatt for BPA konsentrasjoner så lavt som 0,1 µM påvirker ikke-tilknyttet fremre touch habituering hos voksne (n = 60, *p < 0,05). Feilfelt betegne SEM; ANOVA, Tukey's post hoc test. Dette tallet er endret fra Mersha et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Eksponering for miljømessige giftstoffer kan akutt påvirke utviklingen med langsiktige virkninger. Detaljert protokoller er beregnet for å illustrere en strategi med en effektiv labmodell for å studere effekten av tidlig embryonale eksponering bisfenol A. Vi gir fruktbarhet og atferdsmessige analyser å overvåke effektiviteten av våre toxicant eksponering bio-analyser.

Langsiktig opptreden og reproduktive konsekvensene av embryonale eksponering for lav dose giftstoffer

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur og Co-Culture of Mouse Eggstokkene og ovariefollikler

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Vurdering av endotelcelle Migration etter eksponering for giftige kjemikalier

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Bruke<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturer av Whole føtale organer å studere utviklingsprosesser i løpet Mouse organogenesen

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produserte Bovine Pre-implantasjon Embryoet ved hjelp av to-farge microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En Submerged filterpapir Sandwich for Long-term<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging of Early kyllingfoster

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En allsidig monteringsmetode for Long Term Imaging av Sebrafisk Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En enkel kammer for langvarig konfokal imaging av rot og hypokotylutvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langsiktig live Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Samling etter parring sæd fra kvinnelige skjede og måling av sæd LNG i mus

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En i Vivo -metode for å studere musen blod-testikkel barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...