Name: long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Поддержка NSF (EPSCoR EPS-0814251) и благодарностью NIH (1P20GM103653-01A1) MKT и HSD, поддержка институциональных студентов Делавэр государственного университета в МДМ (название III HBGI) и KRS (низ-INBRE). Благодаря C. elegans генетического центра (при поддержке Канцелярии NIH исследовательской инфраструктуры программы P40 OD010110) C. elegans одичал тип N2 штамма.

Протоколы, ниже были стандартизированы для проверки последствий воздействия BPA в раннем эмбриогенезе и могут быть изменены для использования с BPS, БНФ или других ЭЭС и токсикантов на C. elegans эмбрионов.
1. материал установки
<ol><li>Подготовка 500 мл нематода роста СМИ (НГМ)18 СМИ, растворяя 1,5 г NaCl, 1,25 г Пептон и 8,5 г агара в воде до 500 мл. После автоклавирования (121 ° C, 15 PSI, 20 мин) добавьте 0,5 мл (5 мг/мл в этиловом спирте), холестерина 0,5 мл 1 М MgSO4, 0,5 мл 1 М CaCl2 и 12,5 мл 1 М калия фосфат буфера, рН 7,4 (108.3 g KH2PO4 35.6 g K2HPO4, вода 1 Л).</li>
	<li>Подготовьте раствор гипохлорита, смешивая 25 мл 1 N Кох, 4 мл отбеливателя и 71 мл воды. Сделайте это решение свежие.</li>
	<li>Подготовить M9 буфера, смешивая 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 г NaCl, 5 мл 1 м MgSO4, и воды на 1 л.</li>
	<li>Подготовка буфера S18 путем смешивания 129 мл 0,02 М K2HPO4, 871 мл х2PO4и 5.85 г NaCl.</li>
	<li>Стерилизация автоклавированием M9 и S буферов.</li>
	<li>Растут на ночь культуры кишечная палочка (OP 50 штамм) в 20 мл из бульоне Лурия (LB).</li>
	<li>BPA растворяют в 10% этанола сделать Стоковый раствор 1 мм. Сделайте последующих разведениях 0,1 мкм, 0,5 мкм, 1 мкм, 5 мкм и 10 мкм в буфере S. Примечание: Разрежения в буфере водный S значительно уменьшает концентрацию этанола; например высокая концентрация BPA, указанных в настоящем Протоколе (10 мкм), концентрация этанола составляет 0,1% v/v.</li>
</ol>2. C. elegans Culturing и синхронизации
<ol><li>Налить NGM СМИ в 100 мм пластин (около 25 мл/плита) и позволить ему затвердеть. После затвердевшим, семян пластины, распространяя 150 мкл E. coli ОР50 от жидкого культуры, выращенные на ночь. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.</li>
	<li>Следующий день, передачи N2 червей на новые пластины, фрагментации приблизительное плиты площади 1 см. Разрешить червей расти на 3 суток при температуре 20 ° C до тех пор, пока пластины заполняется сытых зрелых взрослых, содержащие видимых эмбрионов.</li>
	<li>Для синхронизации, стирать каждую пластину дозирование до 5 мл буфера M9 через пластину. Передать жидкость стерильные 15 мл конические центрифуги. Примечание: Синхронизация делается для убить взрослых червей и собирать эмбрионов, которые являются относительно той же стадии.</li>
	<li>Центрифуга на 3000 x g 4 мин при комнатной температуре, для того чтобы получить свободные Пелле взрослых червей.</li>
	<li>С помощью пипетки 10 мл, тщательно удалите супернатант таким образом, чтобы оставить нетронутыми гранулы. Добавьте 5 мл раствора гипохлорита и аккуратно перемешать.</li>
	<li>Центрифуга на 3000 x g при комнатной температуре в течение 4 минут.</li>
	<li>Удалить супернатант с 10 мл пипетки и мыть с 7 мл буфера M9. Повторите этот шаг два раза.</li>
</ol>3. выявление червей для анализатора соответствия рекомендациям
<ol><li>После последнего вымывания из шага 2.7 выше приостановите около 100 мкл яиц с M9 буфера. Перевод около 50 мкл яиц до 2 мл пробирки отцентрифугировать уже с соответствующей концентрации, которую BPA разводят в S буфера. Отрегулируйте количество S-буфера, чтобы гарантировать правильную конечная концентрация BPA (0.0 мкм, 0,1 мкм, 0,5 мкм, 1.0 мкм, 5,0 мкм и 10 мкм) в трубку. Таблица 1 иллюстрирует один из способов сделать эти разведениях.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Для окончательного BPA концентрации</td>
			<td>Сток BPA (100 мкм)</td>
			<td>S-буфер</td>
			<td>Синхронизированные черви</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 МКМ</td>
			<td>1 МКЛ</td>
			<td>949 МКЛ</td>
			<td>50 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 МКМ</td>
			<td>5 МКЛ</td>
			<td>945 МКЛ</td>
			<td>50 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 МКМ</td>
			<td>10 МКЛ</td>
			<td>940 МКЛ</td>
			<td>50 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 МКМ</td>
			<td>50 МКЛ</td>
			<td>900 МКЛ</td>
			<td>50 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 МКМ</td>
			<td>100 МКЛ</td>
			<td>850 МКЛ</td>
			<td>50 МКЛ</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Фондовая BPA, S буфер и синхронизированные червей, используемые для достижения желаемой концентрации, для нашего исследования.
<ol start="2"><li>Место труб на шейкере и осторожно встряхните за 4 ч при 20° C, при 25 rpm для поворотного шейкер или 25 наклон/мин для качания шейкер.</li>
	<li>После 4 ч место трубы в Держатели пробки и позволяют червей урегулировать.</li>
	<li>Отменить супернатант и передачи червей в сеяный (НГМ Знаки номерные знаки с ОР50 E. coli). Сделать жидких ОР50 E. coli культуры, как указано в 1,5 и семян пластины, как указано в пункте 2.1.</li>
	<li>Пусть червей расти для 60 h в 20 ° C. Изучите пластины каждый день для загрязнения. Загрязненные пластины NGM обычно бесцветные и сопровождаются отдельными колониями. Проверьте червей под микроскопом переполненности. Отсутствие ОР50 E. coli газон и концентрированные червей в небольших пятен означают переполненности.</li>
</ol>4. Передняя Touch привыкания Assay
<ol><li>Перевести примерно 10 синхронизированные молодых взрослых червей, чтобы новые unseeded NGM пластины с помощью проволоки пожар стерилизовать 30 G Платиновый выбрать. Оставить червей в покое на 5 минут, чтобы дать им время для акклиматизации к новой плите.</li>
	<li>Для привыкания ответ используйте бровь волос, прилагается к концу деревянных шампурах или зубочистку и стерилизовать погружением в 70% этиловом спирте. Протрите чистой безворсовой ткани и подождите 1 мин для этанола для испарения выкл. Нежно коснуться червя на голове (передней глоточные колбы) с использованием бровь волос. Повторите штрихи, позволяя 10 s между штрихами, с тем чтобы позволить червь для восстановления.</li>
	<li>Продолжить на ощупь (разрешение 10 s interstimulus интервалов) до тех пор, пока червь больше не перемещается в обратном направлении. На данный момент червь привыкли на раздражитель. Запишите количество прикосновений, необходимых для червя приучать.</li>
	<li>Анализ разницы между ставками среднее привыкания обработанных и необработанных элементов управления с помощью односторонней ANOVA, следуют Тьюки тест post hoc.</li>
</ol>5. червь плодовитость Assay
<ol><li>Передача отдельных L3 червей свежий и семенами пластине с помощью платины забрать. Убедитесь, что только один червь помещается за тарелку. Примечание: после личиночной стадии L3 черви развиться в личиночной стадии L4 и во взрослой жизни. Выбирая их рано удобно, в том, что они являются достаточно большими для передачи отдельных животных, гарантируя, что они уже не установлены все яйца, которые в противном случае будет не хватать в граф.</li>
	<li>Подсчитать количество яиц каждый 12-24 ч. После подсчета, передачи червь родителя к новой плите. Повторяйте до тех пор, пока червь прекращает откладывают яйца, обычно после 5 дней когда инкубировали при 20 ° C. Примечание: В среднем, дикого типа червь может заложить до 300 яиц; Таким образом передача родителя к новой плите ежедневно предотвращает переполненности.</li>
	<li>Анализируйте разницу между среднее количество яиц, обработанных и необработанных элементов управления с помощью односторонней ANOVA, следуют Тьюки тест post hoc.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют ничего сообщать.

Фазы быстрого роста и развития таких эмбриогенеза особенно уязвимы к пагубные последствия различных соединений, эндокринные нарушения, в том числе BPA. Мы предоставляем подробные протоколы для изучения последствий воздействия BPA или других токсикантов в C. elegans беспозвоночных модели, которая позволяет удобно титрование диапазон концентраций, для того, чтобы оценить его влияние на жизнеспособность эмбриона (рис. 2) . Последующие поведенческих эксперименты на живых взрослых, которые развиваются из эмбрионов, что были подвержены низких доз BPA позволяют опробование долгосрочное воздействие на функции нейронов (рис. 3). Центральная идея настоящего документа-представить подробные протоколы для разоблачения эмбрионов для различных токсикантов в ранний период эмбриогенеза в C. elegans модели; первые 4 ч окно его 11,5 часового периода эмбрионального развития (при 20 ° C) соответствует периода распространения, который сопровождается органогенеза. С этой целью мы предоставили проверки конечных точек через плодовитость и ассоциативные обучения анализов. В то время как механистической основой действий АДС и другие бисфенолов является Святой Грааль, к которой направлена исследования в этой области, у нас не попытка предложить механистическое объяснение действий АДС в этой статье целенаправленной методологии. Однако мы хотели бы указать на то, что модель C. elegans предлагает идеальную систему для дальнейшего изучения механизма действия. Например, в ходе будущей работы по расшифровке механизмы действия BPA C. elegans мутанты могут быть сгенерированы и проверку на стойкость к воздействию BPA и таким образом почву для расшифровки путь. Кроме того наши компаньоны рассматривается воздействие BPA на уровне одновременности нейронной сети в позвоночных, предоставляя другой авеню, чтобы понять основы для изучения потенциальных механизмов токсиканта эффекты19.
В методологии, подробно изложены в настоящем документе, некоторые из важных шагов, которые должны быть казнены загородный тщательно включают следующее: выбор плита с откормленными C. elegans взрослые зрелые яйца видны под микроскопом рассечение имеет решающее значение, и неспособность следовать этот шаг приведет к недостаточной выборки эмбрионов для EDC экспозиции эксперимента. Важно также, чтобы убедиться, что раствор гипохлорита сделан свежий во избежание получения несинхронизированные населения, что будет мешать способности выполнять BPA Выдержка в течение начале эмбриогенеза. Гранулы с M9 (после воздействия гипохлорита) это также очень важный шаг. Если не сделано должным образом, высокая концентрация отбеливателя может привести к мертвых зародышей. Кроме того эмбрионы должны передаваться в сеяный NGM пластины после 4 ч. Если оставить в решении BPA для длительного периода времени, эмбрионы могут развиваться в долгоживущих dauer личинок. Это значительно будет мешать плодовитость пробирного и поведенческих анализов. Если любой из этих шагов является пропустили, желательно, чтобы начать процедуру с самого начала. Если по любой причине, NGM пластины с глистами загрязнена или не имеют достаточного количества продовольствия, он будет добавить стресса на червей, тем самым наклон собранных данных. Такие плиты должны быть отклонены и не использоваться в эксперименте.
Ранее замечательное исследование успешно используется в C. elegans модель продемонстрировать, что хромосомные нарушения, вызванные BPA результат из-за распада ДНК ремонт техники в микрофлорой14. Однако стоит отметить, что выше дизайн исследования использовали непрерывное воздействие BPA C. elegans высоких доз BPA на протяжении всей своей жизни. Наша методология была разработана для изучения малых доз облучения BPA в раннем эмбриогенезе, с целью анализа ее воздействия на жизнеспособность эмбриона и тонкие долгосрочного воздействия на выживших. Насколько нам известно не методология была разработана для предоставления ранней стадии эмбрионов в очень низких дозах BPA, ограничиваясь определенного периода времени; Таким образом что делает метод представлен здесь роман.
Кроме того протоколы условии, здесь может быть легко адаптирована для изучения последствий других ЭЭС на этапе распространения эмбриогенеза. Однако с целью изучения конце эмбриональных стадий, Протокола потребует ключевые изменения в критическое время окно развития под фокус. Кроме того наш протокол не будут пригодны для экспериментов, требующих времени экспозиции токсиканта, как он открывает возможность альтернативного развития пути, что приводит к долгоживущих срок ареста на втором цикле линьки, который устойчив для суровых условий20. Дальнейшие корректировки и уточнения будут необходимы для длительного воздействия раз через дополнение с источником питания, который не имеет потенциал к метаболизму токсикант или EDC например газобетона E. coli. В заключение, наша методология может использоваться для оценки воздействия различных эндокринных, нарушая химических веществ на плодовитость и нейрональных функции в системе беспозвоночных модель C. elegans.

Воздействие экологических токсикантов, особенно соединений, которые склонны вмешиваться с развитием, является предметом тщательного научного изучения в последние годы. Более тысячи химических веществ в быту, классифицируются как эндокринной системы, нарушения соединения (EDC)1. Были отмечены периоды быстрого роста и развития, которые включают эмбриональных, грудных детей и детства этапов, особенно уязвимыми для пагубных последствий для EDC даже низкие дозы. Их влияние было показано, что причиной репродуктивной и нервной расстройств2. С требованиями агентства по охране окружающей среды США и нас Национальной токсикологической программы группа низкой дозы может определяться как любая доза ниже уровня одной, что было сообщено вызывают происходящие биологические изменения или повреждения3. Помимо низкой дозы воздействия отдельных ЭЭС смеси различных ЭЭС, найденных при низких концентрациях в окружающей среде имеют потенциал причинить основной кумулятивный эффект4.
Бисфенол А (BPA или 4,4'-(propane-2,2-diyl)) является агентом полимеризации в часто используемых элементов, таких как бутылки воды, хранить квитанции, стоматологическая герметиков и накладок напитки и еда канистры5. Благодаря его структурное сходство эстрадиол 17-β (E2) и его близость к ERα и ERβ рецепторами эстрогена BPA классифицируется как эндокринной, нарушая химические (EDC)5,6. Хотя слабее, BPA в близость с рецепторами эстрогена было показано влияют репродуктивной системы обоих полов и нарушить нейронные функции в дозах, которые считаются безопасной7,8. Наблюдаются изменения в метилирование ДНК через эпигеномно регулируемых механизмов вызывают долгосрочные нейрональных дефекты в мышей, воздействию BPA9. В частности BPA также был вовлечен как возможные виновником увеличения ставок гиперактивность, дефиците внимания и повышенная чувствительность к препаратам за счет увеличения, видели в D1 дофаминовых рецепторов в лимбической мозга мыши после хронического воздействия 9 , 10. существенные доказательства о пагубных последствиях ЭЭС на здоровье человека основывается на исследованиях корреляции, направленных главным образом на хроническое облучение населения для экологических токсикантов даже при низких дозах5; Однако решая критика необоснованные шумиха11,12были приняты ограничения в выводы из исследований человека и манипулирования экспериментальных элементов управления.
Благодаря сохранению генов Caenorhabditis elegans отношении млекопитающих, в том числе его гены стероидных гормонов рецептор, исследователи использовали этот генетически шансов справиться с возникающими лаборатории модель разгадать функциональные и механистические эффекты ЭЭС 13. эксперименты с C. elegans показали, что эти соединения, как BPA и BPS может вызвать apoptosis, эмбриональных летальность, нарушение в двуцепочечной ДНК перерыв ремонт механизмов и нейронные функции14,15 ,16.
Наша лаборатория ранее показал, что даже низкие дозы облучения, ограниченный в раннем эмбриогенезе приводит к снижению плодородия с поведенческой дефицита в живых взрослых15. Привыкание к неоднократные стимулом является формой ассоциативные обучения в модели систем, включая C. elegans, и наша методология использует эту форму ассоциативные обучения как поведенческих вывода для анализа долгосрочного воздействия эмбриональных подверженности токсикантов17 конкретно, мы предоставляем подробные протоколы для изучения воздействия BPA на C. elegans, включая его немедленное воздействие на эмбриональных летальность и долгосрочное воздействие на поведение взрослых, с общей схемы, изображенные в Рисунок 1. Представитель результаты от плодородия и анализов ассоциативные обучения предоставляются подчеркнуть эффективность нашей методологии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Бисфенолов, таких как бисфенол А (BPA) и бисфенола S (BPS) полимеризовать агентов, широко используется в производстве пластмасс и многочисленные продукты каждый день. Основываясь на их химической структуры и эстрадиол как биологические свойства, они были классифицированы как эндокринной системы, нарушения соединения (EDC). Долгосрочное воздействие даже при низких дозах, в ЭЭС, были связаны с различные дефекты здоровья, включая рак, поведенческих расстройств и бесплодия, с большей уязвимости, указано в ранние периоды развития. Клеточной и молекулярной исследования с моделью генетически шансов справиться с возникающими нематоды Caenorhabditis elegans показали, что воздействие BPA вызывает апоптоз, эмбриональных летальность и потрясений в ДНК восстановительные механизмы. Мы уже ранее сообщали что воздействие C. elegans эмбрионов для низких доз различных бисфенолов уменьшает плодовитость. Кроме того мы показали, что последствия воздействия на самых ранних этапах развития сохраняются в зрелом возрасте, как анализ путем определения количественных показателей привыкание поведение, форма ассоциативные обучения. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для эмбриональных воздействия низких доз ЭЭС, а также связанные плодовитость и передней сенсорных привыкания анализов, наряду с представителем результаты.

Более ранние исследования с C. elegans сообщили, что постоянное воздействие высоких концентраций BPA (≥1 мм) на протяжении всего развития эмбриона и во взрослой жизни снижает плодовитость14. Последующие исследования в нашей лаборатории показали, что эмбрионов, которые подверглись воздействию BPA для ограниченного периода 4 ч в начальной стадии их развития, показал снижение числа жизнеспособных яйца заложены как взрослых15 (рис. 2). Две ключевые особенности методологии были, что (i BPA концентрации используется были значительно ниже (0,1 мкм до 10 мкм диапазон) и (ii воздействие ограничивается раннего эмбрионального периода. Помимо снижения плодовитости даже при более низких дозах наши привыкания анализов показали, что черви подвергаются BPA как эмбрионы требуется больше стимулов, чтобы стать привыкли по сравнению с червей подвергается транспортное средство только15 (рис. 3). Эти эффекты примечательны в том, что они основаны на низких доз BPA выдержка, после обоснования, что тонкие эффекты на нейронные функции, которая не может быть очевидным, морфологически, скорее всего будут заметны через поведенческие изменения. Короче говоря представитель представлены результаты здесь подчеркнуть тот факт, что пагубные последствия воздействия BPA эмбриона влияет на его развитие, включая нейронные функции, которая может оцениваться взрослых поведенческого анализов в C. elegans. Протоколы, здесь может использоваться для тестирования низкой дозы, а также долгосрочные последствия других потенциальных токсикантов, включая эндокринной подрывной соединений.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление экспериментальный дизайн. Зрелые червей были собраны и воздействию гипохлорита раствор для того, чтобы собирать синхронизированных эмбрионов. Эмбрионы были затем подвергается различной концентрации BPA на 4 ч. Подвергаются эмбрионы были переведены на посеян NGM плиты, где они было позволено расти в течение 60 часов при 20 ° C. С целью проверки эффективности воздействия на ранних стадиях развития, L4 червей были переданы отдельных пластин и испытаны для плодовитости, и молодых людей были протестированы с передней касания привыкания. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Рисунок 2: плодовитость снижен BPA. Воздействия 1 мкм и более высокие концентрации BPA значительно сократилось количество яиц, по сравнению с контролем (представленное горизонтальной линией; n = 10, *p < 0,05). Планки погрешностей обозначения SEM. анализа с использованием дисперсионного анализа, Тьюки тест post hoc. Этот рисунок был изменен с Mersha et al., к 2015 году15. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Рисунок 3: долгосрочные последствия воздействия эмбриональных BPA, отражены в поведении взрослых. Эмбрионы воздействию BPA концентраций как низкий, как 0.1 мкм влияет неассоциативных передней касания привыкания у взрослых (n = 60, *p < 0,05). Планки погрешностей обозначения SEM; ANOVA, Тьюки тест post hoc. Этот рисунок был изменен с Mersha et al., к 2015 году15. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Воздействие экологических токсикантов остро может влиять на развитие с долгосрочными последствиями. Подробные протоколы предоставляются для иллюстрации стратегии с использованием модели эффективной лаборатории для изучения влияния ранней эмбриональной воздействия бисфенола а. Мы предоставляем плодовитость и поведенческих анализов для мониторинга эффективности нашей экспозиции токсиканта био-анализов.

Долгосрочные последствия поведенческих и репродуктивного эмбриональных воздействия низких доз ядовитых веществ

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Культура и Co-Культура мыши яичников и фолликулов в яичниках

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Оценка эндотелиальной миграции клеток после воздействия токсичных химических веществ

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

С помощью<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Вертикальный воздушно-капельных Культуры всей фетальных органов по изучению процессов развития во Mouse органогенеза

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Транскриптом профилирование<em&gt; In-Vivo</em&gt; Производимые Бычьи Эмбрионы предимплантационной Использование Двухцветный Microarray платформы

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Затопленный фильтр Сэндвич Бумага для долгосрочного<em&gt; Ex Ово</em&gt; Время покадровой обработки изображений раннего куриных эмбрионов

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Универсальный способ крепления для Long Term Визуализация данио развития

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Простая камера для долговременной конфокальной визуализации развития корней и гипокотилов

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Долгосрочный Живая съемка<em&gt; Drosophila</em&gt; Диски глаз

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Коллекции после спаривания спермы от женского репродуктивного тракта и измерение сжижения спермы мышей

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...