Name: long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Stöd av NSF (EPSCoR EPS-0814251) och NIH (1P20GM103653-01A1) MKT och HSD, Delaware State Universitys institutionella Studentstöd MDM (avdelning III HBGI) och KRS (NIH-INBRE) är erkänt tacksamt. Tack till C. elegans genetiska Center (stöds av NIH kontoret av forskning infrastruktur program P40 OD010110) för C. elegans vildtyp N2 stam.

Protokoll nedan har standardiserats för att testa effekterna av BPA exponering under tidig embryogenes, och kan ändras för användning med BPS, BPF eller andra hormonstörande ämnen och gifter på C. elegans embryon.
1. väsentliga Setup
<ol><li>Förbereda 500 mL av Nematoden Growth Media (NGM)18 media genom upplösning 1,5 g NaCl, 1,25 g pepton och 8,5 g agar i vatten till 500 mL. Efter autoklavering (121 ° C, 15 PSI, 20 min), tillsätt 0,5 mL av kolesterol (5 mg/mL i etanol), 0,5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL av 1 M CaCl2 och 12,5 mL 1 M kalium fosfatbuffert, pH 7,4 (108,3 g KH2PO4 35,6 g K2HPO4, 1 L vatten).</li>
	<li>Förbered hypokloritlösning genom att blanda 25 mL av 1 N KOH, 4 mL av blekmedel och 71 mL vatten. Gör denna lösning färska.</li>
	<li>Förbered M9 buffert genom att blanda 3 g KH2PO4, 6 g av Na2HPO4, 5 g NaCl, 5 mL 1 M av MgSO4och vatten till 1 L.</li>
	<li>Förbereda S buffert18 genom att blanda 129 mL 0,02 M K2HPO4, 871 mL av KH2PO4och 5,85 g NaCl.</li>
	<li>Sterilisera M9 och S buffertar i autoklav.</li>
	<li>Växer en övernattning kultur av Escherichia coli (OP 50 stam) i 20 mL av Luria buljong (LB).</li>
	<li>Lös BPA i 10% etanol att göra en 1 mM stamlösning. Gör efterföljande utspädningar av 0.1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM och 10 µM i S buffert. Obs: Utspädning i vattenlösning S bufferten kraftigt minskar koncentrationen av etanol; exempelvis vid den högsta BPA-koncentrationen som beskrivs i detta protokoll (10 µM), är koncentrationen av etanol 0,1% v/v.</li>
</ol>2. C. elegans Culturing och synkronisering
<ol><li>Häll NGM media i 100 mm plattor (ca 25 mL/platta) och låt den stelna. När stelnat, utsäde plattorna genom att sprida 150 µL av E. coli OP50 från flytande kultur vuxit över natten. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.</li>
	<li>Nästa dag, överföra N2 maskar på nya plattor genom spaltning en ungefärlig platta av 1 cm i fyrkant. Tillåta maskar växa i 3 dagar vid 20 ° C tills plattan fylls med välnärda mogna vuxna som innehåller synlig embryon.</li>
	<li>Om du vill synkronisera, tvätta varje platta för pipettering upp till 5 mL M9 buffert över plattan. Överför vätskan till ett sterilt 15 mL koniskt centrifugrör. Obs: Synkronisering görs för att döda vuxna maskar och samla embryon som är relativt samma scen.</li>
	<li>Centrifugera vid 3 000 x g i 4 min i rumstemperatur för att få en lös pellet av vuxna maskar.</li>
	<li>Med 10 mL pipett noggrant avlägsna supernatanten så att pelleten intakt. Tillsätt 5 mL av hypoklorit lösningen och blanda försiktigt.</li>
	<li>Centrifugera vid 3 000 x g vid rumstemperatur i 4 minuter.</li>
	<li>Ta bort supernatanten med 10 mL pipett och tvätta med 7 mL M9 buffert. Upprepa detta steg två gånger.</li>
</ol>3. exponera maskar att BPA
<ol><li>Efter den sista tvättningen från ovanstående steg 2,7, avbryta cirka 100 µL av ägg med M9 buffert. Överföra ca 50 µL av ägg till 2 mL microfuge rör som redan innehåller lämpliga koncentrationen BPA utspätt i S buffert. Justera mängden S-buffert för att säkerställa rätt slutliga koncentration av BPA (0,0 µM, 0.1 µM, 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM och 10 µM) per rör. Tabell 1 illustrerar ett sätt att göra dessa utspädningar.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>För slutliga BPA koncentration</td>
			<td>Lagerför BPA (100 μM)</td>
			<td>S-buffert</td>
			<td>Synkroniserade maskar</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>850 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Lager BPA, S buffert och synkroniserade maskar som används för att uppnå de önska koncentrationer som används för vår studie.
<ol start="2"><li>Placera rören på en shaker och skaka försiktigt för 4 h vid 20° C, 25 rpm för en skakapparat eller 25 vippar/min för en gungande shaker.</li>
	<li>Efter 4 h, placera rören i tube innehavare och låt maskar sedimentera.</li>
	<li>Kassera supernatanten och överföra maskar till seedade plattor (NGM plattor med OP50 E. coli). Gör flytande OP50 E. coli kulturen som anges i 1.5 och utsäde plattorna som anges i 2.1.</li>
	<li>Låt maskar växa för 60 h i 20 ° C. Undersöka plattor varje dag för kontaminering. Kontaminerade NGM plattor är vanligtvis missfärgade och åtföljas av enskilda kolonier. Kontrollera maskar under lupp för överbeläggning. Brist på OP50 E. coli gräsmatta och koncentrerad maskar i små fläckar beteckna överbeläggning.</li>
</ol>4. främre Touch tillvänjning Assay
<ol><li>Överföra cirka 10 synkroniserade unga vuxna maskar till nya unseeded NGM pläterar med en eld-steriliseras 30 G platina tråd plocka. Lämna maskar ostört för 5 min att låta dem tid att acklimatisera sig till den nya plattan.</li>
	<li>För tillvänjning svar, Använd ett ögonbryn hår bifogas i slutet av en trä spett eller tandpetare och sterilisera genom att doppa i 70% etanol. Torka med en ren luddfri vävnad och vänta 1 min för etanol att dunsta bort. Försiktigt trycka masken på huvudet (främre av faryngeal lampa) använder den ögonbryn hår. Upprepa den berör genom att tillåta 10 s mellan inslag för att möjliggöra masken att återvinna.</li>
	<li>Fortsätter du att peka (tillåta 10 s interstimulus intervall) tills masken inte längre rör sig bakåt. Vid denna punkt, har masken vana på stimulans. Registrera antalet inslag krävs för masken till habituerar.</li>
	<li>Analysera skillnaden mellan de genomsnittliga tillvänjning för de behandlade och obehandlade kontroller med envägs ANOVA följt av Tukey's post hoc-test.</li>
</ol>5. mask fruktsamhet Assay
<ol><li>Överföra enskilda L3 maskar till en fräsch och seedade tallrik med ett platina plocka. Kontrollera att endast en masken placeras per platta. Obs: efter den L3 larvstadium, maskar utvecklas till L4 larvstadium och vuxenliv. Det är bekvämt att plocka dem tidigt genom att de är tillräckligt stora för överföring av enskilda djur samtidigt som de redan inte har lagt några ägg som annars skulle missas i räkningen.</li>
	<li>Räkna antalet ägg som varje 12 – 24 h. Efter inventering, överföra masken förälder till en ny platta. Upprepa tills masken slutar lägga ägg, vanligtvis efter 5 dagar när inkuberas vid 20 ° C. Obs: I genomsnitt en vildtyp mask kan lägga upp till 300 ägg; Därför förhindrar överföra föräldern till en ny platta dagligen överbeläggning.</li>
	<li>Analysera skillnaden mellan det genomsnittliga antalet ägg som av de behandlade och obehandlade kontroller med envägs ANOVA följt av Tukey's post hoc-test.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Författarna förklarar att de har något att avslöja.

Faser av snabb tillväxt och utveckling såsom embryogenes är särskilt känsliga för de skadliga effekterna av olika hormonstörande substanser, inklusive BPA. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll för att studera effekterna av exponering för BPA eller andra gifter i C. elegans ryggradslösa modellen, som möjliggör bekväm titrering av en serie koncentrationer att bedöma dess effekt på embryo livskraft (figur 2) . Följa upp beteende experiment överlevande vuxna som utvecklas från embryon som var utsatta för låga doser av BPA tillåta testmetoder långtidseffekter på nervcellernas funktion (figur 3). Den centrala idén i detta dokument är att ge detaljerade protokoll för utsätta embryon till olika gifter under tidig embryogenes i C. elegans modellen; det första 4 h-fönstret i dess 11,5 timme embryonala utvecklingsperioden (vid 20 ° C) motsvarar perioden spridning, som följs av organogenes. Mot detta syfte har vi tillhandahållit validering slutpunkter genom fruktsamhet och icke-associativ lärande analyser. Medan den mekanistiska grunden för BPA och andra bisphenols åtgärder är den heliga graal som forskning på detta område är att, har vi inte försök att erbjuda en mekanistisk förklaring av BPA åtgärder i denna metodik fokuserad artikel. Vi vill dock påpeka att C. elegans modellen erbjuder ett idealiskt system för att ytterligare dissekera verkningsmekanismen. Till exempel, i framtiden arbeta på dechiffrera BPA verkningsmekanismer, C. elegans mutanter kan genereras och screenas för en motståndskraft mot effekterna av BPA och därmed bana väg för att dechiffrera vägen. Dessutom behandlar våra följeslagare uppsats effekten av BPA på neurala nätverk synchrony nivå hos ryggradsdjur, som tillhandahåller en annan avenue för att förstå grunden för att undersöka potentiella mekanismer för toxiska effekter19.
I den metod som beskrivs i detta papper, några av de kritiska steg som bör utföras extra noggrant omfattar följande: att välja en tallrik med välnärda C. elegans vuxna med mogna ägg synliga under mikroskopet dissektion är avgörande, och underlåtenhet att följa detta steg kommer att resultera i en otillräcklig provstorlek av embryon för EDC exponering experimentet. Det är också viktigt att se till att hypokloritlösning görs färskt att undvika att få en osynkroniserad befolkning som stör förmågan att utföra BPA exponering under tidig embryogenes. Tvätta pellets med M9 (efter hypoklorit exponering) är också ett mycket viktigt steg. Om det inte görs korrekt, kan den höga koncentrationen av blekmedel resultera i döda embryon. Dessutom bör embryon överföras till seedade NGM plattor efter 4 h. Om vänster i BPA lösningen under en längre tid, sannolikt embryona utvecklas till långlivade dauer larverna. Detta kommer att väsentligt störa både fruktsamhet assay och beteendemässiga analyser. Om dessa steg missas, är det lämpligt att starta proceduren från början. Om av någon anledning NGM plattan med maskar är förorenad eller inte har tillräckligt med mat, kommer den lägga stress på maskar därmed skevning insamlade data. Sådana plattor kasseras och användas inte i försöket.
Tidigare använde en anmärkningsvärd studie framgångsrikt C. elegans modellen för att demonstrera att kromosomavvikelser orsakade av BPA resultatet på grund av DNA reparation maskiner i könsceller14. Det är dock anmärkningsvärt att ovanstående studiedesign hade använt kontinuerlig BPA exponering av C. elegans för höga doser av BPA i hela dess livslängd. Vår metodik var avsedd att studera BPA exponering i låga doser under tidig embryogenes, så att assay dess effekter på embryonal livskraft och subtilare långsiktiga effekter på överlevandearna. Till vår kunskap, har ingen metod utvecklats för att avslöja tidiga skede embryon till mycket låga doser av BPA begränsad till en angiven tidsperiod; således presenteras att göra metoden här roman.
Dessutom tillhandahålls protokoll här kan lätt anpassas till studera effekterna av andra hormonstörande ämnen under spridning av embryogenes. Dock behöver för att kunna studera sena embryonala stadier, protokollet viktiga ändringar till fönstret kritisk tid av utveckling under fokus. Dessutom blir våra protokoll inte lämplig för experiment som kräver längre tider av toxiska exponering, eftersom det öppnar upp möjligheten att den alternativa utveckling vägen resulterar i långlivade dauer gripandet vid den andra ömsat cykeln, som är resistent till hårda villkor20. Ytterligare ändringar och förbättringar kommer att behövas för längre exponeringstider genom tillägg med en näringskälla som inte har potential att metabolisera den för människor eller EDC t.ex. Ånghärdad E. coli. Sammanfattningsvis, vår metod kan användas för att bedöma effekterna av olika hormonstörande kemikalier på fruktsamhet och nervcellernas funktion i systemet ryggradslösa modell C. elegans.

Exponering för miljögifter, föreningar särskilt de som tenderar att störa utveckling, har varit under noggrann vetenskaplig granskning under de senaste åren. Mer än tusen kemikalier i dagligt bruk klassificeras som hormonstörande föreningar (EDC)1. Perioder av snabb tillväxt och utveckling, bland annat embryonala, spädbarn och barndom stadier, har noterats för att vara särskilt känsliga för de skadliga effekterna att även låg dos EDC. Deras effekt har visat sig orsaka reproduktiva och nervsystemets sjukdomar2. Per US Environmental Protection Agency och oss National Toxicology Program panel riktlinjerna, kan en låg dos definieras som någon dos under nivån för en som har rapporterats orsaka en observerbar biologisk förändring eller skada3. Förutom låg dos effekter av enskilda hormonstörande ämnen har blandningar av olika hormonstörande ämnen hittades vid låga koncentrationer i miljön potential att orsaka materiella kumulativa effekterna4.
Bisphenol A (BPA eller 4,4'-(propane-2,2-diyl)) är en polymeriserande ämne som återfinns i vanliga föremål såsom vattenflaskor, store kvitton, dental tätningsmedel och foder i dryck och mat burkar5. På grund av dess strukturella likheten till 17-beta östradiol (E2) och dess affinitet till ERα och ERβ östrogenreceptorer, har BPA klassificerats som en hormonstörande kemiska (EDC)5,6. Även om det är svagare, har BPAS affinitet till östrogenreceptorer visat sig påverka systemets reproduktion av båda könen och störa neurala funktioner vid doser som anses säkra7,8. Förändringar i DNA-metylering via epigenetiskt reglerade mekanismer har observerats för att orsaka långsiktiga neurologiska defekter hos möss som utsätts för BPA9. Specifikt, har BPA också varit inblandad som en möjlig skyldige för ökad förekomst av hyperaktivitet, brist på uppmärksamhet och ökad känslighet för läkemedel på grund av en ökning ses hos dopaminreceptorerna D1 i mus limbiska framhjärnan efter kronisk exponering 9 , 10. betydande bevis på de skadliga effekterna av hormonstörande ämnen på människors hälsa bygger på korrelation studier fokuserar främst på kronisk exponering av populationer för miljögifter även vid låga doser5; dock har begränsningar i slutsatser från studier på människa och manipulera experimentella kontroller godkänts samtidigt ta itu med kritiken mot ogrundade hype11,12.
På grund av bevarandet av Caenorhabditis elegans' gener när det gäller däggdjur, inklusive dess steroid hormon-receptor gener, forskare har utnyttjat denna genetiskt eftertraktansvärda lab-modellen för att riva upp de funktionella och mekanistiska effekterna av hormonstörande ämnen 13. experiment med C. elegans har visat att dessa föreningar såsom BPA och BPS kan orsaka apoptos, embryonal dödlighet, störningar i dubbelsträngat DNA paus reparationsmekanismer och neurala funktion14,15 ,16.
Vårt labb har tidigare visat att även låg dos exponering begränsad till tidig embryogenes leder till sänkt fruktsamhet med beteendemässiga underskott i överlevande vuxna15. Tillvänjning till en upprepad stimulans är en form av icke-associativ inlärning i modellsystem, inklusive C. elegans, och vår metodik använder denna form av icke-associativ inlärning som en beteendevetenskaplig utgång till assay långtidseffekterna av embryonala exponering för de gifter17 specifikt, vi tillhandahåller detaljerade protokoll för att studera BPA exponering på C. elegans, inklusive dess omedelbara effekter på embryonal dödlighet och långsiktiga effekter på vuxna beteende, med en övergripande Schematisk som skildras i Figur 1. Representativa resultat från fruktsamhet och icke-associativ lärande analyser ingår för att belysa effektiviteten i vår metodik.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisphenols, såsom bisfenol A (BPA) och bisfenol S (BPS) polymeriserande agenter som ofta används i tillverkningen av plaster och många dagligt använda produkter. Baserat på deras kemiska struktur och estradiol-liknande biologiska egenskaper, har de klassificerats som hormonstörande föreningar (EDC). Långvarig exponering för hormonstörande ämnen, även vid låga doser, har kopplats till olika hälsa defekter inklusive cancer, beteendestörningar och infertilitet, med större sårbarhet indicerat under tidig utvecklingsmässiga perioder. Cellulära och molekylära studier med genetiskt eftertraktansvärda nematoder modellen Caenorhabditis elegans har visat att exponering för BPA orsakar apoptos, embryonal dödlighet och störningar i DNA reparation mekanismer. Vi har tidigare rapporterat att exponering av C. elegans embryon att låga doser av olika bisphenols minskar fruktsamhet. Dessutom har vi visat att effekterna av exponering i mycket tidigt skede av utveckling kvarstår in i vuxenlivet som analyseras av kvantifiera tillvänjning beteende, en form av icke-associativ inlärning. Här, tillhandahåller vi detaljerade protokoll för embryonala exponering för hormonstörande ämnen låg dos samt de associerade fruktsamhet och främre rör tillvänjning analyser, tillsammans med representativa resultat.

Tidigare studier med C. elegans har rapporterat att kontinuerlig exponering för höga koncentrationer av BPA (≥1 mM) hela embryots utveckling och vuxen ålder minskar fruktsamhet14. Efterföljande studier rapporterade från vårt labb har visat att embryon som har exponerats för BPA under en begränsad period på 4 h i början stadier av deras utveckling som visade en minskning av antalet livskraftiga ägg läggas som vuxna15 (figur 2). Två viktiga funktioner för metoden var att a BPA koncentrationer används var betydligt lägre (0.1 µM till 10 µM utbud) och (ii) exponeringen var begränsad till den tidiga embryonala perioden. Förutom Minskad fruktsamhet även vid lägre doser visade våra tillvänjning analyser att maskar utsätts för BPA som embryon krävs mer stimuli till blivit vana jämfört med maskar utsätts för fordon enbart15 (figur 3). Dessa effekter är anmärkningsvärt eftersom de baseras på låg dos BPA exponering, efter motivet att subtila effekter på nervcellernas funktion som inte kanske är morfologiskt tydligt sannolikt kan skönjas genom beteendeförändringar. Kort sagt, presenteras de representativa resultat här understreck det faktum att de skadliga effekterna av BPA exponering av ett embryo effekter dess utveckling, inklusive nervcellernas funktion som kan bedömas genom vuxen beteendemässiga analyser i C. elegans. Protokoll som ges här kan användas för att testa låg dos samt långsiktiga effekter av andra potentiella gifter inklusive endokrina störande föreningar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk bild av experimentell design. Mogen maskar samlades och utsätts för hypokloritlösning för att samla in synkroniserade embryon. Embryona utsattes sedan för olika koncentrationer av BPA i 4 h. De exponerade embryona överfördes till seedade NGM plattor, där de tilläts växa för 60 h vid 20 ° C. För att testa effektiviteten av exponering under de tidiga stadierna av utveckling, L4 maskar var överförs till enskilda plattor och testade för fruktsamhet och unga vuxna testades med främre touch tillvänjning. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Figur 2: fruktsamhet sänks av BPA. Exponering för 1 µM och högre koncentrationer av BPA minskade signifikant antalet ägg som jämfört med kontroll (företrädd av den horisontella linjen. n = 10, *p < 0,05). Felstaplar beteckna SEM. analys har gjorts med ANOVA, Tukey's post hoc-test. Denna siffra har ändrats från Mersha et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Figur 3: långsiktiga effekter av embryonala BPA exponering återspeglas i vuxna beteende. Embryon som utsätts för BPA koncentrationer så låg som 0,1 µM påverkar icke-associativa främre touch tillvänjning hos vuxna (n = 60, *p < 0,05). Felstaplar beteckna SEM; ANOVA, Tukey's post hoc-test. Denna siffra har ändrats från Mersha et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Exponering för miljögifter kan akut påverka utveckling med långsiktiga effekter. Detaljerade protokoll tillhandahålls för att illustrera en strategi med en effektiv lab-modellen för att studera effekten av tidig embryonal exponering för bisfenol A. Vi tillhandahåller fruktsamhet och beteendemässiga analyser att övervaka effektiviteten av våra toxiska exponering bio-analyser.

Långsiktiga beteendemässiga och reproduktiv konsekvenserna av embryonala exponering för låga doser gifter

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur och Co-kultur av Mouse Äggstockar och folliklar

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Bedömning av endotelcellmigration Efter exponering för giftiga kemikalier

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Använda<em&gt; Ex vivo</em&gt; Upright Dropp Kulturer av hela organ hos fostren att studera utvecklingsprocesser under Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom Profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Producerad Bovina Preimplantatorisk embryon med hjälp av två-färg microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En nedsänkt filterpapper Sandwich för långsiktigt<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse avbildning av tidig kycklingembryon

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En mångsidig Monteringsmetod för Long Term avbildning av zebrafisk utveckling

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En enkel kammare för långsiktig konfokalbildning av rot- och hypokotylutveckling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Långsiktig Live avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Ögon Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Samling efter parning sperma från de kvinnliga fortplantningsorganen och mätning av sperma kondensering i möss

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En In Vivo -Metod för att studera mus blod-Testis barriär integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...