Name: long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants
Uploaded: 2018-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

NSF (EPSCoR EPS-0814251) tarafından destek ve NIH (1P20GM103653-01A1) MKT ve HSD, MDM (Başlık III HBGI) ve KRS (NIH-INBRE) Delaware State Üniversitesi Kurumsal öğrenci destek minnetle kabul edilmektedir. C. elegans C. elegans genetik (araştırma altyapı programları P40 OD010110 NIH Office tarafından desteklenen) Merkezi sayesinde vahşi tipi N2 süzün.

Aşağıda verilen iletişim kuralları etkileri BPA maruz kalma sırasında erken embriyogenez test etmek için standart ve bit/sn, BPF veya diğer EDCs ve toxicants C. elegans embriyo üzerinde kullanılmak üzere değiştirilebilir.
1. malzeme Kur
<ol><li>Yuvarlak solucanlar büyüme medya (NGM)18 medya 500 mL 1,5 gr NaCl, pepton 1,25 g ve 8,5 gram agar 500 ml suda çözülerek hazırlayın. (121 ° C, 15 PSI, 20 dk) ısıyla sonra kolesterol (5 mg/mL etanol), 0,5 mL 1 M MgSO4, 0.5 mL 1 M CaCl2 ve 1 M potasyum fosfat tampon, pH 7,4 (108.3 g KH2PO4 12,5 mL 0.5 mL ekleyin. K2HPO4, su 1 M'ye 35,6 g).</li>
	<li>Hipoklorit çözüm 1 N KOH 25 mL, çamaşır suyu 4 mL ve 71 mL su karıştırılarak hazır olun. Bu çözüm taze olun.</li>
	<li>M9 arabellek karıştırma KH2PO43 g, 6 g Na2HPO4, 5 gr NaCl, 5 mL su 1 M'ye ve MgSO41 m hazırlayın</li>
	<li>S arabellek18 0,02 M K2HPO4129 mL, KH2PO4871 mL ve NaCl 5.85 g karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>M9 ve S arabellekleri tarafından ısıyla sterilize.</li>
	<li>Bir gecede kültür Escherichia coli (OP 50 zorlanma) 20 ml Luria suyu (LB) büyümek.</li>
	<li>BPA 1 mM hisse senedi çözüm yapmak için % 10 etanol geçiyoruz. Sonraki dilutions 0,1 µM, 0.5 µM, 1 µM, 5 mikron ve 10 µM S arabellekte olun. Not: Seyreltme sulu S arabellek etanol konsantrasyonu büyük ölçüde azaltır; Örneğin, bu Protokolü (10 µM) açıklanan en BPA yoğun etanol konsantrasyonu % 0,1 v/v olduğunu.</li>
</ol>2. C. elegans Culturing ve eşitleme
<ol><li>NGM medya (yaklaşık 25 mL/plaka) 100 mm kalıplara dökmek ve kuvvetlendirmek sağlar. Bir kez katılaşmış, tabakları E. coli OP50 gecede yetiştirilen sıvı kültüründen 150 µL yayarak tohum. Tabak 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, yaklaşık bir levha 1 cm karelik parçalama tarafından N2 solucanlar yeni plakalar üzerine aktarın. Solucanlar plaka görünür embriyo içeren iyi beslenmiş olgun yetişkin ile doldurulur kadar 20 ° C'de 3 gün boyunca büyümeye izin.</li>
	<li>Eşitlemek için her plaka plaka arasında en fazla 5 mL M9 arabelleği pipetting tarafından yıkayın. Sıvı bir steril 15 mL konik santrifüj tüpü aktarın. Not: Eşitleme yetişkin solucanlar öldürmek ve nispeten aynı sahne olan embriyo toplamak için yapılır.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 4 dk 3000 x g de yetişkin solucanlar gevşek bir Pelet elde etmek için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>10 mL pipet kullanarak, pelet olduğu gibi bırakmak böylece süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. 5 mL hipoklorit çözeltisi ekleyin ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>3000 x g oda sıcaklığında de 4 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>10 mL pipet ile süpernatant kaldırmak ve M9 arabellek 7 mL ile yıkayın. Bu iki kez tekrarlayın.</li>
</ol>3. solucanlar için BPA maruz
<ol><li>Yukarıda adım 2.7 gelen son yıkama sonra yumurta M9 arabelleği ile yaklaşık 100 µL askıya alma. Yaklaşık 50 µL yumurta 2 mL microfuge tüpler zaten BPA S arabellekte seyreltilmiş uygun konsantrasyon içeren aktarın. BPA (0.0 µM, 0,1 µM, 0.5 µM, 1.0 µM, 5.0 µM ve 10 µM) doğru son konsantrasyonu tüp ücret sağlamak için S-arabellek miktarını belirleyin. Tablo 1 bir yolu bu dilutions göstermektedir.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Son BPA konsantrasyon için</td>
			<td>Stok BPA (100 mikron)</td>
			<td>S arabellek</td>
			<td>Eşitlenmiş solucanlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 MİKRON</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>949 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 MİKRON</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>945 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 MİKRON</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>940 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 MİKRON</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>900 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 MİKRON</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>850 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Hisse senedi BPA, S arabellek ve senkronize solucanlar çalışmamız için kullanılan istenen konsantrasyonları ulaşmak için kullanılan.
<ol start="2"><li>Bir shaker tüpler yerleştirin ve nazikçe 20 ° C'de, döner bir shaker için 25 rpm ya da sallanan bir shaker 25 Eğer/dk'ya 4 h için sallamak.</li>
	<li>4 h sonra tüpler tüp sahipleri yerleştirin ve solucanlar yerleşmek sağlar.</li>
	<li>Süpernatant atın ve solucanlar numaralı seribaşı Tabaklar (NGM tabaklar OP50 E. coliile) aktarın. Sıvı OP50 E. coli kültür 1,5 belirtildiği gibi yapmak ve tabakları 2.1 belirtildiği gibi temel olarak belirler.</li>
	<li>20 ° c 60 h için büyümek solucanlar izin Levhalar her gün kirlenme için inceleyin. Kirlenmiş NGM tabak genellikle renksiz ve bireysel koloniler tarafından eşlik etti. Aşırı kalabalık için mikroskop altında onay solucanlar. OP50 E. coli çim ve küçük spot renkleri de konsantre solucan eksikliği aşırı kalabalık anlamına gelir.</li>
</ol>4. ön Touch Habituation tahlil
<ol><li>Yaklaşık 10 eşzamanlı genç yetişkin solucanlar için bir yangın sterilize 30 G Platin tel kullanarak yeni seribaşı NGM plakaları almak aktarın. Solucanlar onlara izin vermek 5 min için rahatsız bekletin yeni plaka parkenizin vakti.</li>
	<li>Habituation yanıt için bir tahta şiş veya kürdan sonu iliştirilmiş bir kaş saç kullanın ve % 70 etanol daldırma tarafından sterilize. Temiz havsız bir doku ile silin ve etanol kapalı buharlaşır için 1 dk bekleyin. Solucan (faringeal ampul anterior) kafasına hafifçe dokun kaş saç kullanarak. 10 izin dokunuşlar, tekrar s arasında solucan kurtarmak izin vermek için dokunur.</li>
	<li>(10 s interstimulus aralıkları izin verir) solucan artık geriye doğru taşır kadar dokunmaya devam edin. Bu noktada, solucan için uyarıcı habituated. Solucan alıştırmak gerekli dokunuşlar kaydedin.</li>
	<li>Tek yönlü ANOVA Tukey'nın öğleden hoc testi ile takip kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse denetimlerini ortalama habituation oranları arasındaki fark analiz.</li>
</ol>5. solucan verimlilik tahlil
<ol><li>Bireysel L3 solucanlar bir taze ve numaralı seribaşı tabak Platin bir pick kullanarak aktarın. O sadece bir solucan plaka yerleştirildiğinden emin olun. Not: L3 larva aşamadan sonra solucanlar geliştirmek L4 larva sahne ve yetişkinlik. Onlar zaten kadar hangi başka türlü-sayıma özledim herhangi bir yumurta bırakırlar değil sağlarken bireysel hayvanlar transferi için yeterince büyük onları erken seçmek uygun olmamasıdır.</li>
	<li>Her 12-24 h koydu yumurta sayıları saymak. Sayım sonra üst solucan yeni bir tabağa aktarın. Solucan yumurtaları, genellikle 5 gün sonra durana kadar tekrar ne zaman 20 ° C'de inkübe Not: ortalama 300 yumurta bir vahşi türü solucan düzenleyebilirsiniz; Bu nedenle, üst yeni bir tabak için günlük aktarma aşırı kalabalık engeller.</li>
	<li>Tek yönlü ANOVA Tukey'nın öğleden hoc testi ile takip kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse denetimleri barındırmanın yumurta ortalama sayısı arasındaki farkı analiz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Yazarlar onlar ifşa birşey yok bildirin.

Hızlı büyüme ve embriyogenez gibi geliştirme aşamalarını BPA de dahil olmak üzere çeşitli endokrin engellemeden bileşikler zararlı etkilerini özellikle güvenlik açığından etkilenir. Detaylı iletişim kuralları, BPA veya diğer toxicants uygun titrasyon konsantrasyonları embriyo canlılık (Şekil 2) üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir dizi sağlar C. elegans omurgasız modelindeki maruz kalma etkileri eğitimi için sağlar . Davranışsal deney vardı BPA maruz düşük doz izin veren nöronal fonksiyon (şekil 3) üzerinde uzun vadeli etkileri raporlaması embriyo geliştirmek yetişkin kalan izleyin. Bu kağıt Merkez C. elegans modelindeki erken embriyogenez döneminde embriyolar için çeşitli toxicants maruz kalmaları için detaylı iletişim kuralları sağlamak için fikir; ilk 4 h penceresinde 11.5 saat embriyonik gelişim süresi (20 ° C'de) organogenesis tarafından takip nükleer silahların yayılmasına karşı döneme karşılık gelen. Bu amaçla doğru biz doğrulama verimlilik ve ilişkisel öğrenme deneyleri ile uç noktalarından sağladı. BPA ve diğer bisphenols eylem mekanik temeli olan doğru bu alanda araştırma hedefleniyor Kutsal Kase olmakla birlikte, BPA eylem bu metodoloji odaklı makalede için mekanik bir açıklama denemesi var. Ancak, C. elegans modeli daha fazla etki mekanizmaları incelemek için ideal bir sistem sunar işaret etmek istiyorum. Örneğin, gelecekte iş mekanizmaları BPA eyleminin deşifre C. elegans mutantlar oluşturulacak ve BPA etkileri bir direnç için ekranlı ve böylece yolu deşifre için önünü. Ayrıca, bizim arkadaş kağıt BPA omurgalılarda, yaydıkları etkileri19olası mekanizmaları araştıran için temel anlamak için başka bir avenue sağlayan neural ağ senkronizasyonu düzeyde etkisi ile ilgilidir.
Bu yazıda ayrıntılı metodoloji-meli var olmak kritik adımları bazı ekstra idam dikkatle şunları içerir: bir tabak iyi beslenmiş C. elegans ile seçme Yetişkin Olgun yumurta diseksiyon mikroskop altında görünür ile çok önemli, ve Bu adım takip etmek başarısız EDC pozlama deney için embriyo yetersiz örneklem büyüklüğü neden olur. Hipoklorit çözüm BPA maruz kalma sırasında erken embriyogenez gerçekleştirme olanağı çalışmasına engel eşitlenmemiş bir popülasyon alma önlemek için taze yapılmış olduğundan emin olmak önemlidir. M9 ile granül (hipoklorit maruz kaldıktan sonra) yıkama da çok önemli bir adımdır. Düzgün yapılmazsa, çamaşır suyu yüksek yoğunlukta ölü embriyoların neden olabilir. Ayrıca, embriyo numaralı seribaşı NGM plakaları için 4 h sonra aktarılmalıdır. BPA çözümde uzun bir süre için terk etseydi, embriyo uzun ömürlü dauer larva geliştirmek muhtemeldir. Bu önemli ölçüde verimlilik tahlil ve davranışsal deneyleri ile engel olacaktır. Bu adımlardan herhangi birini kaçırdıysanız, bu yordamı en başından başlamak için tavsiye edilir. Herhangi bir nedenle NGM plaka ile solucan bulaşmış mı veya yeterli yiyecek yok, böylece toplanan veriler eğriltme solucanlar üzerinde stres ekler. Böyle tabak atılmalıdır ve deneyde kullanılmayacak.
Daha önce dikkate değer bir çalışma başarıyla C. elegans modeli kromozom anomalileri arıza nedeniyle BPA sonucu DNA onarım makineleri germline14kaynaklanan göstermek için kullanılmıştır. Ancak, bu yukarıdaki çalışma tasarım C. elegans sürekli BPA maruz kalma BPA onun ömrü boyunca yüksek dozda kullanmış olduğu dikkat çekicidir. Metodolojimiz BPA maruz kalma düşük dozlarda, embriyonik canlılığı üzerindeki etkileri ve kurtulanların üzerinde ince uzun vadeli etkileri tahlil böylece erken embriyogenez sırasında çalışma için tasarlanmıştır. Bilgimizi, hiçbir metodoloji erken sahne embriyolar için belirli bir süre için sınırlı BPA çok düşük dozlarda ortaya çıkarmak için geliştirilmiştir; Böylece, yapım yöntemi burada roman sundu.
Buna ek olarak, iletişim kuralları burada diğer EDCs etkileri nükleer silahların yayılmasına karşı embriyo aşamasında çalışmaya kolayca adapte olabilir sağladı. Ancak, geç embriyonik aşamada çalışma için protokol geliştirme odak altında kritik zaman penceresi için anahtar değişiklikler gerektirir. Dayanıklı ikinci molting döngüsü, içinde uzun ömürlü dauer tutuklama kaynaklanan alternatif kalkınma yolu olasılığını açılır gibi Ayrıca, bizim iletişim kuralı yaydıkları maruz kalma, daha uzun zaman gerektiren deneyleri için uygun olmayacaktır sert koşulları20' ye. Daha fazla değişiklik ve iyileştirmeler ile ilave toxicant veya EDC örneğin metabolize potansiyeline sahip değil bir besin kaynağı ile uzun pozlama süreleri için gerekecektir autoclaved E. coli. Sonuç olarak, metodolojimiz çeşitli endokrin kimyasallar verimlilik ve nöronal fonksiyon omurgasız modeli sistem engellemeden etkilerini değerlendirmek için kullanılması gereken C. elegans.

Çevre toxicants, maruz özellikle bileşikleri bu müdahale ile Geliştirme eğilimindedir, dikkatli bilimsel inceleme altında son yıllarda olmuştur. Günlük kullanım içinde binlerce kimyasal bileşikler (EDC)1engellemeden endokrin sınıflandırılır. Hızlı büyüme ve embriyonik, Bebek içerir geliştirme ve çocukluk dönemlerinde bile düşük doz EDC için zararlı etkilere özellikle savunmasız kalmaktan kaydetti. Onların etkisi gösterilmiştir üreme ve nörogelişimsel bozuklukları2neden olan. ABD Çevre Koruma Ajansı ve ulusal toksikoloji programı bize paneli yönergeleri düşük doz gözlemlenebilir bir biyolojik değişikliğe veya3zarar vermek için bildirilen bir seviyesinin altında herhangi bir doz olarak tanımlanabilir. Bireysel EDCs düşük doz etkileri yanı sıra çeşitli EDCs ortamında düşük konsantrasyonlarda bulundu karışımları maddi toplu etkileri4neden potansiyeline sahip.
Bisfenol A (BPA ya da 4,4'-(propane-2,2-diyl)) su şişeleri, mağaza girişleri, diş Dolgu macunları ve içecek balataları gibi sık kullanılan öğeleri bulunan bir polymerizing Ajan ve gıda kutular5. 17-β Estradiol (E2) için yapısal benzerlik ve onun benzeşme ERα ve ERβ östrojen reseptörleri nedeniyle, BPA kimyasal (EDC)5,6engellemeden bir endokrin sınıflandırması. Her ne kadar zayıf, BPA'ın benzeşme östrojen reseptörleri her iki cinsiyette üreme sistemini etkileyen ve güvenli7,8kabul edilen dozda sinir fonksiyonları bozabilir olduğu gösterilmiştir. DNA metilasyonu epigenetically düzenlenmiş mekanizmaları yoluyla değişimler BPA9' a maruz farelerde uzun vadeli nöronal hatalarına neden olduğu gözlenmiştir. Özellikle, BPA da hiperaktivite, dikkat eksikliği ve uyuşturucu kronik maruz kaldıktan sonra D1 dopamin reseptörleri fare limbik ön görülen artış nedeniyle artan duyarlılık artış oranları için olası bir suçlu olarak karıştığı olmuştur 9 , 10. EDCs insan sağlığı üzerinde zararlı etkileri üzerinde önemli kanıt korelasyon çalışmalar kronik teshir edilmesi bile, düşük doz5; çevre toxicants nüfusu çoğunlukla odaklanan temel alır Ancak, sınırlamalar çıkarımlar insan çalışmalar ve deneysel kontrolleri manipüle eleştiriler asılsız hype11,12hitap ederken kabul edildi.
Memelilerin açısından Caenorhabditis elegans genlerin korunması nedeniyle, dahil onun steroid hormon reseptör genleri, araştırmacılar bu genetik olarak uysal lab modelini EDCs fonksiyonel ve mekanik etkileri çözmeye kullanılan 13. C. elegans ile deneyler bu bileşiklerin BPA ve bit/sn gibi Apoptozis, embriyonik ölümcül, bozulma çift iplikçikli DNA ara tamir mekanizmaları ve sinirsel işlev14,15'neden olabileceğini göstermiştir ,16.
Bizim laboratuvar daha önce bile düşük doz pozlama için erken embriyogenez sınırlı kalan yetişkin15davranışsal açıkları ile indirdi verimlilik yol açar göstermiştir. Tekrarlanan bir uyarana habituation bir sigara ilişkisel öğrenme modeli sistem, C. elegans, dahil formudur ve metodolojimiz bu formu olmayan ilişkisel öğrenme embriyonik maruz uzun vadeli etkileri tahlil için bir davranış çıktı olarak kullanıp toxicants17 özellikle, biz ayrıntılı iletişim kuralları BPA maruz C. elegansembriyonik ölümcül hemen etkisi ve yetişkin davranışı üzerinde uzun vadeli etkileri ile içinde tasvir bir genel şematik de dahil olmak üzere üzerinde çalışmak için sağlar Şekil 1. Verimlilik ve ilişkisel öğrenme deneyleri temsilcisi sonuçları metodolojimiz etkinliğini vurgulamak için sağlanır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisphenols, Bisfenol A (BPA) gibi ve Bisfenol S (BPS) plastik ve çok sayıda her gün kullanım ürünleri üretiminde yaygın olarak kullanılan ajanlar polymerizing. Kendi kimyasal yapısı ve östradiol benzeri biyolojik özellikleri dayalı, onlar bileşikler (EDC) engellemeden endokrin sınıflandırılmış. EDCs, uzun süreli maruz kalma düşük dozlarda bile, erken gelişim dönemleri sırasında gösterilen büyük güvenlik açığı ile kanser, davranış bozuklukları ve kısırlık, dahil olmak üzere çeşitli sağlık kusurları bağlı. Hücresel ve moleküler çalışmalar genetik olarak uysal nematodunun modeliyle Caenorhabditis elegans BPA maruz apoptosis neden olur, embriyonik ölümcül ve bozulma DNA'daki mekanizmaları onarım göstermiştir. Daha önce farklı bisphenols azalır verimlilik düşük doz bu maruz kalma C. elegans embriyo bildirdin. Buna ek olarak, biz pozlama geliştirme çok erken aşamalarında etkileri habituation davranış, bir form sigara ilişkisel öğrenme miktarının tarafından denetlesinler gibi yetişkinlik inat göstermiştir. Burada, embriyonik maruz kalma düşük doz EDCs yanı sıra ilişkili verimlilik ve ön detaylı iletişim kuralları ile birlikte temsilcisi sonuçları habituation deneyleri touch sağlamak.

C. elegans ile daha önceki çalışmalar yüksek BPA konsantrasyonları (≥1 mM) embriyo gelişimi ve yetişkinlik boyunca sürekli maruz kalma verimlilik14azalır bildirdi. Sonraki çalışmalar bizim laboratuardan rapor için BPA gelişimlerine uygun yumurta sayısı bir düşüş gösterdi, başlangıç evrelerinde 4 h sınırlı bir süre için maruz kalmış embriyo yetişkin15 (Şekil 2) koydu göstermiştir. Metodoloji iki temel özellikleri kullanılan (i BPA konsantrasyonları önemli ölçüde (10 µM Aralık için 0,1 µM) daha düşük ve (ii) maruz kalma erken embriyonik dönem için sınırlı olduğunu edildi. Daha düşük dozlarda bile, azalan verimlilik yanı sıra bizim habituation deneyleri embriyo solucanlar için karşılaştırıldığında habituated olmak için daha fazla bir çekim gücü gerektiği için BPA maruz solucanlar araç tek başına15 ' e (şekil 3) maruz ortaya koydu. Bu efektleri önemli düşük doz BPA maruz kalma, morfolojik belirgin olmayabilir nöronal fonksiyon üzerinde ince etkileri davranış değişiklikleri ayırt olmak muhtemeldir mantığı aşağıdaki temel vardır. Kısacası, temsilcisi sonuçları burada zararlı etkileri BPA maruz kalma bir embriyo gelişimi C. elegansyetişkin davranış deneyleri ile değerlendirildi nöronal işlevi de dahil olmak üzere, etkileri aslında alt çizgi sundu. Burada sağlanan protokoller endokrin yıkıcı bileşikler de dahil olmak üzere diğer potansiyel toxicants düşük doz yanı sıra uzun vadeli etkilerini test etmek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Şekil 1: deneysel tasarım şematik gösterim. Olgun solucanlar toplanmış ve senkronize embriyo toplamak için hipoklorit çözüm için maruz. Embriyo sonra 4 h için farklı konsantrasyonları BPA maruz bırakıldı. Nerede 20 ° C'de 60 h için büyümeye izin verildi numaralı seribaşı NGM levha, maruz kalan embriyo transfer Geliştirme erken evrelerinde pozlama etkinliğini test etmek için L4 solucanlar için bireysel plakalar transfer ve verimlilik için test, ve genç yetişkinler ön dokunmatik habituation ile test edildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Şekil 2: verimlilik BPA tarafından indirdi. 1 µM ve daha yüksek konsantrasyonlarda BPA maruz önemli ölçüde koydu yumurta sayısı (yatay çizgiyle; temsil denetim kıyasla azalmıştır n = 10, *p < 0,05). Hata çubukları SEM ANOVA, Tukey'nın öğleden hoc testi kullanarak analiz göstermek. Bu rakam Mersha vd., 201515değiştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Şekil 3: embriyonik BPA maruz kalma uzun vadeli etkileri yetişkin davranışını yansıtılır. BPA konsantrasyonları 0,1 µM ilişkilendirilemez ön dokunmatik habituation yetişkin etkiler gibi düşük maruz embriyo (n = 60, *p < 0,05). Hata çubukları SEM göstermek; ANOVA, Tukey'nın hoc testi sonrası. Bu rakam Mersha vd., 201515değiştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Çevre toxicants maruz akut geliştirme uzun vadeli etkileri ile etkileyebilir. Detaylı iletişim kuralları Bisfenol A. için erken embriyonik pozlama etkisini incelemek için bir etkili lab modelini kullanarak bir strateji göstermek için sağlanan Sağladığımız verimlilik ve bizim yaydıkları pozlama biyo-deneyleri etkinliğini izlemek için davranışsal deneyleri.

Embriyonik maruz kalma düşük doz Toxicants uzun vadeli davranış ve üreme sonuçları

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...