Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (81650110527, 81371400) et la National clé base Research Programme of China (2013CB530900).

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux politiques de la société des neurosciences (USA) et des comités d’éthique Fudan University (Shanghai, Chine). Cette procédure est pour une chirurgie sans survie.
1. installation d’appareils de Collection CSF
<ol><li>Tirez le verre capillaire (diamètre intérieur 0,75 mm, diamètre extérieur 1,0 mm) en utilisant un micropipettes (comme le montre Liu et al. 10; affûtée capilla...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

Ce protocole décrit en détail une technique qui améliore le cours méthodes10 collection CSF pour minimiser la contamination du sang et permettre la collection abondante du CSF (en moyenne ~ 10-15 µL peuvent être obtenues) de souris. Lors de la rupture de la pointe capillaire, l’extrémité du capillaire ne doit pas être trop petite (comme à l’époque le CSF sera extrait de très lentement) ou trop gros (sera ne pas assez pour recueillir le CSF fine et tissus peuvent se loger dans le tu...

Le CSF est un liquide organique précieux pour l’analyse de la recherche en neurosciences. Le CSF est principalement fabriqué à partir de plasma sanguin, contenant peu de cellules (sans culots globulaires et seulement quelques cellules de sang blanches) et est presque exempt de protéines. C’est l’un des fluides en contact étroit avec le système nerveux central (CNS) et il peut passer des électrolytes beaucoup du cerveau et la moelle épinière vers le système périphérique. Chez l’homme, échantillons de LCR peuvent être recueillis pour aider à diagnostiquer la maladie ou à des fins de recherche dans les essais cliniques, comme une ponction lombaire (ou ponction lombaire) est une procédure invasive mineure : le fluide de CSF peut refléter des changements dans le système nerveux central sans avoir à accéder directement à ces tissus. Ainsi, ces dernières années, à des fins de recherche à la clinique, les échantillons de LCR ont été obtenus de patients atteints de maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer et autres démences1,2,3. Il existe plusieurs tests de biomarqueurs qui ont été développés en utilisant des échantillons de LCR pour éventuellement aider dans le diagnostic des maladies à la clinique2,3. Cependant, il y a beaucoup de débats sur la fiabilité de ces tests pour produire des résultats constants et sensibles pour diagnostiquer précisément la maladie4,5. Donc, il y a un grand besoin pour le développement de la meilleure des dosages et des objectifs qui peuvent être trouvés dans le LCR, pour aider à produire une technique standard pour diagnostiquer les maladies neurodégénératives avec plus de sensibilité et de spécificité. En raison de l’importance potentielle des échantillons de LCR humaines dans la maladie, la collection du CSF de rongeurs dans la recherche en neurosciences est également intéressant.
Les souris sont des animaux importants dans la recherche biologique et médicale et permettant l’analyse de composés thérapeutiques potentiels et les études de validation avant d’essais cliniques humains. Cependant, chez les souris il est difficile d’obtenir des échantillons de LCR en raison de sa proximité au cerveau dans un petit animal, étant donné que la méthode habituelle de CSF collection chez la souris doit l’obtenir par l’intermédiaire de la cisterna magna, une ouverture entre le cervelet et la surface dorsale du bulbe rachidien. Cela provoque des difficultés dans la collecte d’échantillons de LCR car cette zone est difficile à décortiquer à et à proximité des vaisseaux sanguins, augmentant le risque de contamination par les globules. En raison de ces difficultés, la plupart des chercheurs ne peuvent obtenir une petite quantité de LCR pour analyse (habituellement soit le µL 5-7) et la contamination des échantillons de LCR par les globules est une préoccupation majeure pour les analyses6,7,8 , 9. contamination de sang peut obscurcir les résultats et ne reflète pas véritablement l’état de la CNS. En outre, limitée de l’échantillon recueillie peut avoir un impact recherche que la quantité habituelle provenant de souris suffit pour qu’une seule mesure (en double ou triple exemplaire) à l’aide de dosage immuno-enzymatique (ELISA). Ainsi, échantillons de LCR sont habituellement mis en commun de plusieurs souris afin d’avoir suffisamment d’échantillon pour exécuter plusieurs tests. Élaboration d’un protocole pour les abondants, collection non contaminée du FSC provenant de souris est vivement souhaitée et sera bénéfique dans l’amélioration de la recherche en neurosciences à l’aide de rongeurs.
Dans ce protocole, une technique pour les abondantes (en moyenne 10-15 µL) collection de peste porcine classique chez des souris anesthésiés est décrit en détail et améliore sur une méthode actuellement connue de collection de CSF pour minimiser la contamination du sang,10. Un protocole robuste pour collection CSF facilitera le développement de dosages de biomarqueurs axée sur le CSF, qui pourrait être utilisé pour aider à diagnostiquer la maladie, en plus d’améliorer la recherche sur les mécanismes qui sous-tendent les maladies affectant le système nerveux central.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un liquide organique précieux pour l’analyse de la recherche en neurosciences. Il est l’un des fluides en contact plus proche avec le système nerveux central et ainsi, peut être utilisé pour analyser l’État malade du cerveau ou la moelle épinière sans accéder directement à ces tissus. Cependant, chez les souris, qu'il est difficile d’obtenir de la magna de cisterna en raison de sa proximité aux vaisseaux sanguins, qui contaminent souvent échantillons. La zone pour collection CSF chez la souris est aussi difficile à décortiquer à et souvent seulement de petits échantillons sont obtenus (maximum de 5-7 µL ou moins). Ce protocole décrit en détail une technique qui améliore les méthodes actuelles de collecte pour minimiser la contamination du sang et permettre la collection abondante du LCR (en moyenne que 10-15 µL peuvent être collectées). Cette technique peut servir à d’autres méthodes de dissection pour la collection de tissus provenant de souris, car il n’influe pas sur les tissus lors de l’extraction de la CSF. Ainsi, le cerveau et la moelle épinière ne sont pas affectés par cette technique et restent intacts. Avec une plus grande collecte d’échantillons de CSF et pureté, des analyses plus peuvent être utilisés avec ce fluide d’autre aide la recherche en neurosciences et mieux comprennent les maladies qui touchent le cerveau et la moelle épinière.

Utilisant la procédure décrite ici (Figure 1 et Figure 2), la CSF immédiatement recueilli dans le tube capillaire doit être transparent (Figure 2E), pas rose ou rouge. S’il y a une rose à la teinte rouge vers le liquide recueilli dans le tube capillaire, puis il y a eu contamination par le sang.
Comme un exemple de l’application de...

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An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Ce protocole décrit une technique améliorée pour la collection abondante de liquide céphalo-rachidien (LCR) sans la contamination du sang. Avec une plus grande collecte d’échantillons et de la pureté, des analyses plus peuvent être effectuées à l’aide de CSF pour faire avancer notre compréhension des maladies qui affectent le cerveau et la moelle épinière.

Une méthode améliorée pour la collecte du liquide céphalo-rachidien de souris anesthésiés

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

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