Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81650110527, 81371400) und National Key Basic Research Programm of China (2013CB530900) unterstützt.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien der Gesellschaft für Neurowissenschaften (USA) und der Fudan-Universität (Shanghai, China) ethischen Komitees durchgeführt. Dieses Verfahren ist für eine Operation nicht überleben.
1. Aufbau des CSF Sammlung Apparat
<ol><li>Ziehen Sie das Glas Kapillare (Innendurchmesser 0,75 mm, Außendurchmesser 1,0 mm) mit einer Mikropipette Abzieher (wie in Liu Et Al. gezeigt 10; geschärfte Kapillare ist in <strong cl...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine Technik, die auf aktuellen Methoden10 der CSF-Sammlung zu minimieren Kontamination aus Blut und ermöglichen die reichhaltige Sammlung von CSF verbessert (durchschnittlich ~ 10-15 µL erzielt werden) von Mäusen. Wenn die Kapillare Spitze zu brechen, die Spitze der Kapillare sollte nicht zu klein (wie damals die CSF wird extrahiert werden sehr langsam) sein oder zu groß (wird nicht fein genug, um die CSF sammeln und Gewebe in der Kapillare eingereicht we...

CSF ist eine wertvolle Körperflüssigkeit für die Analyse in der neurowissenschaftlichen Forschung. Die GfK besteht hauptsächlich aus Blutplasma, mit wenigen Zellen (keine roten Blutkörperchen und nur ein paar weiße Blutkörperchen) und ist fast frei von Protein. Es ist eine der Flüssigkeiten in engem Kontakt mit dem zentralen Nervensystem (ZNS) und es kann viele Elektrolyte aus dem Gehirn und Rückenmark an das periphere System übergeben. Beim Menschen, CSF Proben kann erhoben werden, um Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten oder für Forschungszwecke in klinischen Studien als eine Lumbalpunktion (oder Lumbalpunktion) ist eine kleinere, invasive Verfahren: die CSF Flüssigkeit kann Änderungen im ZNS ohne direkt auf diese zugreifen Gewebe. So wurden in den letzten Jahren zu Forschungszwecken in der Klinik, CSF Proben von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit und anderen Demenzerkrankungen1,2,3gewonnen. Es gibt viele Biomarker-Assays, die entwickelt wurden, mit CSF Proben möglicherweise Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten in der Klinik2,3. Allerdings gibt es viel Debatte über die Zuverlässigkeit dieser Tests zu konsistenten, sensible Ergebnissen um gezielt diagnostizieren Krankheit4,5. So, gibt es ein großer Bedarf an der Entwicklung besserer Assays und Ziele, die im Liquor gefunden werden können, um Hilfe bei der Herstellung ein Standardverfahren zur diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen mit größere Sensitivität und Spezifität. Aufgrund der potenziellen Bedeutung des CSF Humanproben bei Krankheit ist die Sammlung von CSF von Nagetieren in der neurowissenschaftlichen Forschung auch von Interesse.
Mäuse sind wichtige Tiere in biologischen und medizinischen Forschung und für die Prüfung von möglichen therapeutischen Verbindungen und Proof-of-Concept-Studien vor der klinischen Studien am Menschen erlauben. Jedoch bei Mäusen ist es schwierig, CSF Proben wegen seiner Nähe zum Gehirn in ein kleines Tier zu erhalten, da die übliche Methode der CSF-Sammlung bei Mäusen ist es über die Cisterna Magna, eine Öffnung zwischen dem Kleinhirn und der dorsalen Oberfläche des der Medulla Oblongata zu erhalten. Dies führt zu Schwierigkeiten in CSF Proben zu sammeln, da dieser Bereich schwierig zu sezieren und in unmittelbarer Nähe für Blutgefäße, erhöht die Gefahr der Kontamination von Blutzellen. Aufgrund dieser Schwierigkeiten die meisten Forscher erhalten nur eine kleine Menge von CSF Analyse (in der Regel als 5-7 µL angegeben) und die Verunreinigung von CSF Proben von Blutkörperchen ist ein Hauptanliegen für Analysen6,7,8 , 9. Blut Verunreinigungen kann Ergebnisse zu verschleiern und nicht wirklich spiegeln den Stand des ZNS. Darüber hinaus kann begrenzt Probe Forschung auswirken, da die üblichen Menge gesammelt von Mäusen nur einer Messung (in doppelt oder dreifach) reicht mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA). CSF Proben sind somit in der Regel aus mehreren Mäusen gebündelt, um genügend Blut mehrere Tests ausgeführt haben. Entwicklung eines Protokolls für die reichlich, unberührten Sammlung von CSF von Mäusen ist sehr erwünscht und werden bei der Verbesserung der neurowissenschaftlichen Forschung mit Nagetieren vorteilhaft.
In diesem Protokoll, eine Technik für die reichlich (durchschnittlich 10-15 µL) Sammlung von CSF von narkotisierten Mäuse wird ausführlich beschrieben und verbessert auf eine derzeit bekannte Methode der CSF Sammlung, Kontamination von Blut10zu minimieren. Ein robustes Protokoll für CSF Sammlung hilft bei der Entwicklung von CSF-basierte Biomarker Assays, die verwendet werden könnte, um Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten sowie die Verbesserung der Forschung über die Mechanismen, die Erkrankungen des ZNS zugrunde liegen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

Der Liquor cerebrospinalis (CSF) ist eine wertvolle Körperflüssigkeit für die Analyse in der neurowissenschaftlichen Forschung. Es ist eines der Flüssigkeiten im engsten Kontakt mit dem zentralen Nervensystem und kann daher verwendet werden, um den kranken Zustand des Gehirns oder des Rückenmarks zu analysieren, ohne direkten Zugriff auf diese Gewebe. Bei Mäusen ist es schwer zu bekommen aus der Cisterna Magna wegen seiner guten Anbindung an den Blutgefäßen, verunreinigen die jedoch oft Proben. Die CSF-Sammlung bei Mäusen ist auch schwerlich zu sezieren und oft nur kleine Proben (maximal 5-7 µL oder weniger) erzielt werden. Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine Technik, die über die aktuellen Methoden der Sammlung zu minimieren Kontamination aus Blut und ermöglichen die reichhaltige Sammlung von CSF (im Durchschnitt 10-15 µL gesammelt werden können) verbessert. Diese Technik kann mit anderen Dissektion Methoden für Gewebe-Sammlung von Mäusen, verwendet werden, da es keinem Gewebe während der CSF Extraktion auswirkt. So im Gehirn und Rückenmark sind mit dieser Technik nicht betroffen und bleiben intakt. Mit größeren CSF Musterkollektion und Reinheit weitere Analysen können mit dieser Flüssigkeit weiter Hilfe neurowissenschaftliche Forschung verwendet werden und Krankheiten, die das Gehirn und das Rückenmark besser zu verstehen.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren (Abbildung 1 und Abbildung 2), sollte sofort in die Kapillare gesammelt CSF klar (Abb. 2E), nicht rosa oder rot sein. Wenn es eine rosa bis roten Schimmer auf die Flüssigkeit in der Kapillare gesammelt gibt, dann gab es Kontamination mit Blut.
Ein Beispiel für die Anwendung der CSF Probe mit dieser Met...

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An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Technik für die reichhaltige Sammlung von zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) ohne Kontamination aus Blut. Mit größeren Musterkollektion und Reinheit können weitere Analysen mit CSF, um unser Verständnis von Krankheiten zu fördern, die das Gehirn und das Rückenmark betreffen durchgeführt werden.

Ein verbessertes Verfahren zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis aus narkotisierten Mäuse

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Forschung

Neurowissenschaften

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Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten<em&gt; Drosophila</em

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Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

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