Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
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इस काम को चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६५०११०५२७, ८१३७१४००) और चीन के राष्ट्रीय प्रमुख बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2013CB530900) ने समर्थन दिया था.

समाज तंत्रिका विज्ञान (यूएसए) और फुदन विश्वविद्यालय (शंघाई, चीन) नैतिक समितियों की नीतियों के अनुसार सभी पशु प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया । यह प्रक्रिया एक गैर उत्तरजीविता सर्जरी के लिए है ।
...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल विस्तार से एक तकनीक जो सीएसएफ संग्रह के10 वर्तमान तरीकों पर सुधार करने के लिए रक्त से संदूषण को कम करने और सीएसएफ के प्रचुर मात्रा में संग्रह के लिए अनुमति देने का वर्णन (औसत पर ~ 10-15 µ ...

सीएसएफ तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान शरीर द्रव है । सीएसएफ मुख्य रूप से रक्त प्लाज्मा से बना है, जिसमें कुछ कोशिकाओं (कोई लाल रक्त कोशिकाओं और केवल कुछ सफेद रक्त कोशिकाओं) और लगभग प्रोटीन से मुक्त है । यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के साथ निकट संपर्क में तरल पदार्थ में से एक है और यह मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से परिधीय प्रणाली के लिए कई इलेक्ट्रोलाइट्स पारित कर सकते हैं । मानव में, सीएसएफ नमूने रोग निदान में सहायता करने के लिए एकत्र किया जा सकता है या नैदानिक परीक्षणों में अनुसंधान प्रयोजनों के लिए, एक रीढ़ की हड्डी के रूप में नल (या काठ का पंचर) एक छोटी सी, इनवेसिव प्रक्रिया है: सीएसएफ द्रव सीधे इन तक पहुँचने के लिए बिना सीएनएस में परिवर्तन को प्रतिबिंबित कर सकते हैं ऊतकों. इस प्रकार, हाल के वर्षों में, क्लिनिक में अनुसंधान प्रयोजनों के लिए, सीएसएफ के नमूने अल्जाइमर रोग और अन्य परिवारजन1,2,3जैसे neurodegenerative रोगों के रोगियों से प्राप्त किए गए हैं. वहां कई है जो कि सीएसएफ के नमूनों का उपयोग कर विकसित किया गया है क्लीनिक में रोगों के निदान में सहायता के लिए2,3। हालांकि, इन परख की विश्वसनीयता पर बहुत बहस के लिए संगत, संवेदनशील परिणाम विशेष रूप से रोग का निदान करने के लिए4,5का उत्पादन है । तो, वहां बेहतर परख और लक्ष्य है, जो सीएसएफ में पाया जा सकता है के विकास के लिए एक बड़ी जरूरत है, एक मानक तकनीक के उत्पादन में सहायता के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ neurodegenerative रोगों का निदान । रोग में मानव सीएसएफ के नमूनों के संभावित महत्व के कारण, तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में कुतर से सीएसएफ का संग्रह भी ब्याज की है.
चूहों जैविक और चिकित्सा अनुसंधान में महत्वपूर्ण जानवर है और संभावित चिकित्सीय यौगिकों और मानव नैदानिक परीक्षणों से पहले सबूत के अवधारणा अध्ययन के परीक्षण के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, चूहों में यह एक छोटे से पशु में मस्तिष्क के लिए अपनी निकटता के कारण सीएसएफ के नमूनों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, चूहों में सीएसएफ संग्रह की सामान्य विधि के रूप में यह cisterna magna, सेरिबैलम और मज्जा oblongata के पृष्ठीय सतह के बीच एक खोलने के माध्यम से प्राप्त करने के लिए है. इस क्षेत्र के लिए और करीब निकटता में रक्त वाहिकाओं के लिए काटना मुश्किल है के रूप में यह सीएसएफ के नमूनों को इकट्ठा करने में कठिनाई का कारण बनता है, रक्त कोशिकाओं से संदूषण के जोखिम में वृद्धि. इन कठिनाइयों के कारण, ज्यादातर शोधकर्ताओं केवल विश्लेषण के लिए सीएसएफ की एक छोटी राशि प्राप्त कर सकते हैं (आमतौर पर 5-7 µ एल के रूप में कहा जाता है) और रक्त कोशिकाओं द्वारा सीएसएफ के नमूनों की संदूषण विश्लेषण के लिए एक प्राथमिक चिंता का विषय है6,7,8 , 9. रक्त दूषण परिणाम अस्पष्ट कर सकते हैं और सही मायने में सीएनएस की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं. इसके अलावा, सीमित नमूना एकत्र कर सकते है अनुसंधान के रूप में सामांय चूहों से एकत्र की राशि केवल एक ही माप के लिए पर्याप्त है (डुप्लिकेट या तपसिल में) एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) का उपयोग कर । इस प्रकार, सीएसएफ नमूनों आमतौर पर कई चूहों से जमा कर रहे हैं क्रम में करने के लिए पर्याप्त कई परख चलाने के लिए नमूना है. चूहों से सीएसएफ के प्रचुर मात्रा में, दूषित संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का विकास बहुत वांछित है और कुतर का उपयोग कर तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में सुधार लाने में लाभकारी होगा ।
इस प्रोटोकॉल में, प्रचुर मात्रा में (10-15 µ एल के एक औसत) anesthetized चूहों से सीएसएफ के संग्रह के लिए एक तकनीक विस्तार से वर्णित है और सीएसएफ संग्रह के वर्तमान में एक ज्ञात विधि पर सुधार करने के लिए रक्त से संक्रमण को कम करने के लिए10. सीएसएफ संग्रह के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल सीएसएफ के विकास में सहायता करेगा आधारित है, जो रोग निदान में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही तंत्र में अनुसंधान में सुधार है कि आबाद रोगों सीएनएस को प्रभावित ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान शरीर द्रव है । यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ निकटतम संपर्क में तरल पदार्थ में से एक है और इस प्रकार, सीधे इन ऊतकों तक पहुँचने के बिना मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के रोगग्रस्त राज्य का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, चूहों में यह cisterna magna से रक्त वाहिकाओं, जो अक्सर नमूने दूषित करने के लिए अपनी निकटता के कारण प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । चूहों में सीएसएफ संग्रह के लिए क्षेत्र भी काटना करने के लिए मुश्किल है और अक्सर केवल छोटे नमूनों प्राप्त कर रहे हैं (अधिकतम 5-7 µ l या कम). इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन एक तकनीक है कि संग्रह के वर्तमान तरीकों पर सुधार के लिए रक्त से संदूषण को कम करने और सीएसएफ के प्रचुर मात्रा में संग्रह के लिए अनुमति (औसत 10-15 µ एल पर एकत्र किया जा सकता है) । इस तकनीक का उपयोग चूहों से ऊतक संग्रह के लिए अन्य विच्छेदन विधियों के साथ किया जा सकता है, क्योंकि यह सीएसएफ निष्कर्षण के दौरान किसी भी ऊतकों को प्रभावित नहीं करता है । इस प्रकार ब्रेन और स्पाइनल कॉर्ड इस तकनीक से प्रभावित नहीं होते और बरकरार रहते हैं । अधिक से अधिक सीएसएफ नमूना संग्रह और शुद्धता के साथ, अधिक विश्लेषण इस तरल पदार्थ के साथ आगे सहायता तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान और बेहतर मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को प्रभावित करने वाले रोगों को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यहां उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करना (चित्रा 1 और चित्रा 2), सीएसएफ तुरंत केशिका में एकत्र स्पष्ट (चित्रा 2E) होना चाहिए, नहीं गुलाबी या लाल. यदि केशिका में एक?...

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An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

इस प्रोटोकॉल रक्त से कोई संदूषण के साथ मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) के प्रचुर मात्रा में संग्रह के लिए एक बेहतर तकनीक का वर्णन । अधिक से अधिक नमूना संग्रह और शुद्धता के साथ, अधिक विश्लेषण सीएसएफ का उपयोग कर रोगों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है कि मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को प्रभावित.

Anesthetized चूहों से मस्तिष्कमेरु द्रव के संग्रह के लिए एक बेहतर तरीका

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

Research

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