Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation of China (81650110527, 81371400) e nazionali chiave base ricerca programma della Cina (2013CB530900).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le politiche della società per le neuroscienze (USA) e comitati etici Fudan University (Shanghai, Cina). Questa procedura è per un intervento chirurgico non-sopravvivenza.
1. installazione dell'apparecchiatura di raccolta di CSF
<ol><li>Tirare il vetro capillare (diametro interno 0,75 mm, diametro esterno mm 1,0) usando un estrattore micropipetta (come mostrato in Liu et al. 10; affi...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica che migliora il corrente metodi10 di accumulazione di CSF per minimizzare la contaminazione da sangue e consentire la raccolta abbondante di CSF (in media ~ 10-15 µ l può essere ottenuta) dai topi. Rompendosi la punta capillare, la punta del capillare non deve essere troppo piccola (è come allora verranno estratti molto lentamente il CSF) o troppo grande (non sarà abbastanza per raccogliere il CSF bello e tessuto può rimanere incastrato nel ...

Il CSF è un prezioso fluido corpo per analisi in ricerca in neuroscienza. Il CSF è principalmente fatta da plasma sanguigno, contenente alcune cellule (non di globuli rossi e pochi globuli bianchi) ed è quasi privo di proteine. È uno dei fluidi a stretto contatto con il sistema nervoso centrale (SNC) e può passare molti elettroliti dal cervello e il midollo spinale al sistema periferico. In esseri umani, i campioni di CSF possono essere raccolti per aiutare nella diagnosi di malattia o per scopi di ricerca negli studi clinici, come una puntura lombare (o puntura lombare) è una procedura invasiva, minore: il fluido di CSF può riflettere le modifiche nel SNC senza dover accedere direttamente a queste tessuti. Così, negli ultimi anni, per scopi di ricerca in clinica, i campioni di CSF sono stati ottenuti da pazienti di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e altre demenze1,2,3. Ci sono molti saggi di biomarcatore che sono stati sviluppati utilizzando campioni di liquor per potenzialmente diagnosticare malattie in clinica2,3. Tuttavia, c'è molto dibattito sull'affidabilità di questi test per produrre risultati coerenti e sensibili per specificamente diagnosticare malattia4,5. Così, c'è un grande bisogno per lo sviluppo migliore nei test di obiettivi, che possono essere trovati nel CSF, per aiutare nella produzione di una tecnica standard per diagnosticare malattie neurodegenerative con maggiore sensibilità e specificità. A causa dell'importanza potenziale di campioni di CSF umano nella malattia, la collezione di CSF dai roditori in ricerca in neuroscienza è anche di interesse.
I topi sono animali importanti nella ricerca biologica e medica e consentono per la prova dei composti terapeutici potenziali e studi di prova prima di test clinici umani. Tuttavia, nei topi è difficile ottenere campioni di CSF grazie alla sua vicinanza al cervello in un piccolo animale, come il metodo usuale di accumulazione di CSF in topi è ottenerlo via della cisterna, un'apertura tra il cervelletto e superficie dorsale del oblongata del midollo. Questo provoca difficoltà nella raccolta dei campioni di CSF come questa zona è difficile da sezionare per e in prossimità di vasi sanguigni, aumentando il rischio di contaminazione da parte di cellule del sangue. A causa di queste difficoltà, la maggior parte dei ricercatori possono ottenere solo una piccola quantità di CSF per analisi (solitamente indicato come µ l 5-7) e la contaminazione dei campioni di CSF dalle cellule del sangue è una preoccupazione primaria per analisi6,7,8 , 9. contaminazione sanguigna può oscurare i risultati e non veramente riflettere lo stato del SNC. Inoltre, limitato campione raccolto può influire la ricerca come la solita quantità raccolte da topi è sufficiente per la sola misura (in doppio o triplice copia) utilizzando analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). Così, campioni di liquor sono solitamente in pool da topi multipli al fine di avere abbastanza campione per eseguire saggi multipli. Sviluppo di un protocollo per l'abbondante, collezione incontaminato di CSF dai topi è fortemente desiderato e sarà utile nel miglioramento della ricerca neuroscientifica utilizzando roditori.
In questo protocollo, una tecnica per l'abbondante (una media di 10-15 µ l) insieme di CSF da topi anestetizzati è descritta dettagliatamente e migliora il metodo attualmente conosciuto di accumulazione di CSF per minimizzare la contaminazione da sangue10. Un protocollo robusto per accumulazione di CSF sarà di aiuto nello sviluppo di analisi di biomarker basati su CSF, che potrebbero essere utilizzati per diagnosticare la malattia, come pure di migliorare la ricerca dei meccanismi che sono alla base di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

Il liquido cerebrospinale (CSF) è un prezioso fluido corpo per analisi in ricerca in neuroscienza. È uno dei fluidi in più stretto contatto con il sistema nervoso centrale così, può essere utilizzato per analizzare lo stato di malato del cervello o del midollo spinale senza accedere direttamente a questi tessuti. Tuttavia, nei topi che è difficile da ottenere dalla cisterna magna grazie alla sua vicinanza ai vasi sanguigni, che spesso contaminare i campioni. La zona per accumulazione di CSF in topi è anche difficile da sezionare per e spesso solo piccoli campioni sono ottenuti (massimo di 5-7 µ l o meno). Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica che migliora sugli attuali metodi di raccolta per minimizzare la contaminazione da sangue e consentire la raccolta abbondante di CSF (in media che 10-15 µ l possono essere raccolti). Questa tecnica può essere utilizzata con altri metodi di dissezione per raccolta di tessuto dai topi, come non impatto eventuali tessuti durante l'estrazione di CSF. Così, il cervello e il midollo spinale non sono interessati con questa tecnica e rimangono intatti. Con una maggiore raccolta di campioni di CSF e purezza, ulteriori analisi possono essere utilizzati con questa ricerca in neuroscienza fluido ad ulteriori aiuti e comprendere meglio le malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.

Utilizzando la procedura descritta qui (Figura 1 e Figura 2), il CSF immediatamente raccolti nel capillare dovrebbe essere chiaro (Figura 2E), non rosa o rosso. Se c'è una rosa a tinta rossa al fluido raccolto nel capillare, poi c'era contaminazione con il sangue.
Come un esempio di applicazione del campione di CSF raccolti con questo meto...

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An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Questo protocollo descrive una tecnica migliore per la raccolta abbondante di liquido cerebrospinale (CSF) senza contaminazione da sangue. Con una maggiore raccolta di campioni e purezza, altre analisi possono essere eseguite utilizzando CSF per avanzare la nostra comprensione delle malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.

Un metodo migliore per la raccolta di liquido cerebrospinale da topi anestetizzati

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

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