Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81650110527, 81371400)와 키 기본 연구 프로그램의 중국 국가 (2013CB530900)에 의해 지원 되었다.

모든 동물 실험 신경 과학 (미국), 복 단 대학 (상하이, 중국) 윤리 위원회에 대 한 협회의 정책에 따라 수행 했다. 이 절차는 비 생존 수술입니다.
1입니다. CSF 컬렉션 장치 설치
<ol><li>유리 모 세관 당겨 (내경 0.75 m m, 외부 직경 1.0 m m) 같이 사용 하는 micropipette 끌어당기는 사람 (리 우 외. 10; 날카롭게 모 세관에에서 표시 됩니다 그림 1</s...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

이 프로토콜 설명 자세히 혈액 오염 최소화 및 CSF의 풍부한 컬렉션에 대 한 허용 CSF 컬렉션의 현재 방법10 에 향상 (평균 ~ 10-15 µ L를 얻을 수 있다) 쥐에서. 모 세관 끝을 깨는, 모 세관의 끝 해서는 안됩니다 (그럼 CSF 추출 됩니다 매우 느리게) 너무 작은 또는 너무 큰 (되지 않습니다 CSF 수집을 충분히 잘 하 고 조직 모 세관에서 제기 될 수 있다). 주의 해야 때 CSF 컬렉션에 대 한 영...

CSF 분석 신경 과학 연구에 대 한 귀중 한 체액 이다. CSF는 주로, (아니 붉은 혈액 세포와만 몇 백혈구) 몇 셀을 포함 하 고는 거의 단백질-무료. 그것 하나는 체액의 중앙 신경 시스템 (CNS)와 가까이 접촉에서 이며 전달할 수 많은 전해질 밖으로 두뇌 및 척수 주변 시스템을. 인간에서는, CSF 샘플 수집 질병 진단에 도움이 될 수 있습니다 또는 임상 시험에서 연구 목적, 척추 수돗물 (또는 요 추 찔린)으로 사소한, 침략 적 절차: CSF 액체가에 직접 액세스 하지 않고 CNS에 변화를 반영할 수 있다 조직입니다. 따라서, 병원, 연구 목적을 위해 최근 몇 년 동안에서 CSF 샘플 Alzheimer의 질병, 다른 치 매1,2,3같은 신경 퇴행 성 질환의 환자에서 얻이 되었습니다. 많은 잠재적으로 클리닉2,3에서 질병 진단에 도움이 CSF 샘플을 사용 하 여 개발 된 바이오 마커 분석 실험을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 구체적으로 진단 질병4,5일관성, 민감한 결과를 이러한 분석의 신뢰성에 많은 논쟁이 있다. 그래서, 큰 감도와 특이성 신경 퇴행 성 질환을 진단 하는 표준 기술을 생산에 도움이 더 나은 분석 및 목표, CSF에서 찾을 수 있습니다, 개발에 대 한 중대 한 필요가 있다. 질병에서 인간 CSF 샘플의 잠재적인 중요성 때문 신경 과학 연구에 설치류에서 CSF의 컬렉션의 관심 이기도합니다.
마우스 생물학과 의학 연구에 중요 한 동물 고 잠재적 치료 화합물 및 인간 임상 시험 전에 개념 증명 연구의 테스트에 대 한 허용 한다. 그러나, 쥐에서 어렵습니다 작은 동물, 뇌의 친밀감 때문에 CSF 샘플을 얻기 위해 생쥐에서 CSF 컬렉션의 일반적인 방법은 시스테 마그나, 소 뇌 수 질 oblongata의 등 쪽 표면 사이 개통을 통해 그것을 얻을 하는 것입니다. 어려움으로이 지역에 해 부 어렵다 CSF 샘플을 수집 하 고 혈관, 혈액 세포에서 오염의 위험이 증가에 가까운 근접에서 발생 합니다. 이러한 어려움 때문에 대부분 연구자만 분석 (일반적으로 5-7 µ L로 명시 된)에 대 한 CSF의 작은 금액을 가져올 수 있습니다 및 혈액 세포에 의해 CSF 견본의 오염 분석6,,78 에 대 한 주요 관심사는 , 9. 혈액 오염 결과 보이지 않게 수 고 하지 진정으로 CNS의 상태를 반영. 쥐에서 수집 된 일반적인 금액으로 충분 한 측정 (또는 3 중) 제한 된 샘플 수집 연구를 충격 하는 또한, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)을 사용 하 여. 따라서, CSF 샘플 충분 한 샘플을 여러 분석 실험을 실행 하기 위해 여러 마우스에서 일반적으로 풀링됩니다. 풍부한에 대 한 프로토콜을 개발, 쥐에서 CSF의 오염의 컬렉션은 크게 원하는 하 고 설치류를 사용 하 여 신경 과학 연구를 개선에 도움이 될 것입니다.
이 프로토콜, 풍부한 기술 (평균 10-15 µ L) 마 취 쥐에서 CSF의 컬렉션 자세히 설명 하 고 피10에서 오염을 최소화 하기 위해 CSF 컬렉션의 현재 알려진된 방법에 향상. CSF 컬렉션에 대 한 강력한 프로토콜 CSF 기반 바이오 마커 분석, 질병 진단에 도움이 CNS에 영향을 미치는 질병의 기반이 되는 메커니즘을 연구 개선 하는 데 사용 수의 개발에 도움이 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

뇌 척추 액체 (CSF) 분석 신경 과학 연구에 대 한 귀중 한 체액 이다. 그것은 중앙 신 경계와 가까운 접촉에서 체액 중 하나입니다 하 고 따라서,이 조직에 직접 액세스 하지 않고 뇌 또는 척수의 병 상태를 분석에 사용할 수 있습니다. 그러나, 쥐 혈관의 친밀감 때문 시스테 마그나에서 얻기 어렵다,이 종종 샘플 오염. 마우스에 CSF 컬렉션에 대 한 지역에 해 부도 어렵습니다 그리고 종종 작은 샘플 (5-7 µ L의 최대 또는 더 적은) 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 자세하게에서 혈액 오염 최소화 (평균 10-15 µ L를 수집할 수 있습니다)에 CSF의 풍부한 컬렉션에 대 한 허용 하는 컬렉션의 현재 방법에 향상 하는 기술을 설명 합니다. 이 기술은 그것 CSF 추출 하는 동안 모든 조직에 영향을 하지 않습니다 마우스에서 조직 컬렉션에 대 한 다른 해 부 방법으로 사용할 수 있습니다. 따라서, 뇌와 척수가이 기법으로 영향을 받지 않습니다 하 고 그대로 유지. 큰 CSF 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석이 더 액체 보조 신경 과학 연구에 사용할 수와 더 나은 두뇌 및 척수에 영향을 미치는 질병을 이해.

(그림 1 및 그림 2) 여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 모 세관에 즉시 수집 CSF 클리어 (그림 2E), 분홍색 또는 빨간색 이어야 한다. 액체는 모 세관에서 수집에 붉은 가미에 분홍색 경우 혈액으로 오염이 했다.
CSF 샘플의 응용 프로그램의 예를 들어가이 방법으로...

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An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

이 프로토콜에는 혈액에서 오염 없이와 뇌 척추 액체 (CSF)의 풍부한 컬렉션에 대 한 향상 된 기술을 설명합니다. 큰 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석 두뇌 및 척수에 영향을 질병의 우리의 이해를 추가 CSF를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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측면 유체 타악기 : 마우스의 외상성 뇌 손상 모델

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연구

신경과학

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해부하는 뇌 두피 Explants와 함께 사용하기위한 쥐 태아의 뇌척수의 절연

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

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행동 분석 실험에 대한 염색 곤충 : 마취의 짝짓기 행동<em&gt; 초파리</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

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의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

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This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

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형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

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