Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81650110527, 81371400) og National nøkkelen grunnleggende forskning Program i Kina (2013CB530900).

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med politikken til samfunnet for nevrovitenskap (USA) og Fudan University (Norge) etiske komiteer. Denne prosedyren er for en ikke-overleve kirurgi.
1. oppsett av CSF samling apparater
<ol><li>Trekke glasset kapillær (indre diameter 0,75 mm ytre diameter 1.0 mm) bruker en brønnene avtrekker (som vist i Liu et al. 10; skjerpet kapillær er vist i figur 1).</li>
	<li>Plasser et skjerpet glas...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

Denne protokollen beskriver i detalj en teknikk som forbedrer på gjeldende metoder10 av CSF samling å redusere forurensning fra blod og tillate rikelig samlingen av CSF (gjennomsnittlig ~ 10-15 µL fås) fra mus. Når bryte kapillær spissen, spissen av av kapillær bør ikke være for liten (som da CSF vil trekkes veldig sakte) eller for stor (vil ikke bli fint nok å samle CSF og vev kan bli lodged i av kapillær). Forsiktighet bør utvises når dissekere området for CSF samling: blødninger ...

CSF er en verdifull kroppen væske for analyse i nevrovitenskap forskning. CSF er hovedsakelig laget av blod plasma, som inneholder noen celler (ingen røde blodlegemer og bare et par hvite blodlegemer) og er nesten protein-fri. Det er en av væsker i nær kontakt med sentralnervesystemet (CNS) og det kan gå mange elektrolytter fra hjernen og ryggmarg til det eksterne systemet. Hos mennesker, CSF prøver kan samles som hjelp til å diagnostisere sykdom eller til forskningsformål i kliniske forsøk, som popbransjen (eller lumbale punktering) er en mindre, invasiv prosedyre: CSF væsken kan gjenspeile endringer i CNS uten å direkte tilgang vev. Dermed de siste årene, for forskningsformål i klinikken, er CSF prøver anskaffet fra pasienter av nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom og andre dementias1,2,3. Det er mange biomarkør analyser som har blitt utviklet ved hjelp av CSF prøver for å hjelpe diagnostisere sykdommer i klinikken2,3. Men er det mye debatt på påliteligheten av disse analyser å produsere konsistente, følsom resultater å spesielt diagnostisere sykdom4,5. Så, det er et stort behov for utvikling av bedre analyser og mål, som finnes i CSF, som hjelp til å produsere en standard teknikk å diagnostisere nevrodegenerative sykdommer med større sensitivitet og spesifisitet. På grunn av potensielle viktigheten av menneskelig CSF prøver i sykdom er samlingen av CSF fra gnagere i nevrovitenskap forskning også av interesse.
Mus er viktig dyr i biologisk og medisinsk forskning og lar for testing av potensielle terapeutiske forbindelser og proof-of-concept studier før kliniske studier. Men i mus er det vanskelig å få CSF eksempler på grunn av sin nærhet til hjernen i en liten dyr, som den vanlige metoden av CSF samling i mus er å få det via cisterna magna, en åpning mellom lillehjernen og dorsal overflaten av forlengede. Dette fører i samle CSF eksempler som dette området er vanskelig å dissekere til og i nærheten blodkar, øker risikoen for forurensning fra blod celler. Disse vanskelighetene, de fleste forskere kan bare få en liten mengde CSF for analyse (vanligvis oppgitt som 5-7 µL) og forurensning av CSF prøver av blod celler er et hovedanliggende for analyser6,7,8 , 9. blod forurensning kan skjule resultater og ikke virkelig gjenspeiler tilstanden til CNS. Videre begrenset utvalg samlet kan påvirke forskning som vanlig beløp fra mus er nok for bare ett mål (i duplikat eller tre eksemplarer) bruker enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA). Dermed er CSF prøver vanligvis samlet fra flere mus for å ha nok prøve å kjørt flere analyser. Utvikle en protokoll for de rike, forurenset samling av CSF fra mus er sterkt ønsket og vil være gunstig å bedre nevrovitenskap forskning ved hjelp av gnagere.
I denne protokollen, en teknikk for den rike (et gjennomsnitt på 10-15 µL) samling av CSF fra bedøvet mus er beskrevet i detalj og forbedrer kjente metode av CSF samling å redusere forurensning fra blod10. En robust protokoll for CSF samling hjelper i utviklingen av CSF-baserte biomarkør analyser, hvilke kan brukes å hjelpe diagnostisere sykdom, samt forbedre forskning i mekanismer underlie sykdommer CNS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

Cerebrospinalvæske (CSF) er en verdifull kroppen væske for analyse i nevrovitenskap forskning. Det er en av væsker i nærmeste kontakt med sentralnervesystemet og dermed kan brukes til å analysere syke statusen til hjernen eller ryggmargen uten direkte tilgang til disse vev. Men i mus er det vanskelig å få fra cisterna magna på grunn av sin nærhet til blodårene, som ofte forurense prøver. Området for CSF samling i mus er også vanskelig å dissekere til og ofte bare små utvalg hentes (maksimum 5-7 µL eller mindre). Denne protokollen beskriver i detalj en teknikk som forbedrer gjeldende metoder for samling å redusere forurensning fra blod og tillate rikelig samlingen av CSF (i gjennomsnitt 10-15 µL kan samles). Denne teknikken kan brukes med andre disseksjon metoder for vev samling fra mus, så det ikke påvirker noen vev under CSF utvinning. Dermed hjernen og ryggmarg påvirkes ikke med denne teknikken og forblir intakt. Med større CSF prøvetaking og renhet, flere analyser kan brukes med denne flytende ytterligere hjelp nevrovitenskap forskning og forstå sykdommer som påvirker hjernen og ryggmargen.

Bruker du fremgangsmåten her (figur 1 og figur 2), bør CSF umiddelbart samlet av kapillær være klart (figur 2E), ikke rosa eller rød. Hvis det er en rosa til rød skjær til væsken samles i av kapillær, så var det forurensning med blod.
Som et eksempel på bruk av CSF prøven samlet med denne metoden, nivåer av protein amyloid-beta...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice at JoVE.com

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Denne protokollen beskriver en forbedret teknikk for rikelig innsamling av cerebrospinalvæske (CSF) med ingen forurensning fra blodet. Med større prøvetaking og renhet, kan flere analyser utføres med CSF for å fremme vår forståelse av sykdommer som påvirker hjernen og ryggmargen.

En forbedret metode for samling av cerebrospinalvesken fra bedøvet mus

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering av spinalvæske fra Rodent embryo for bruk med dissekert Cerebral Kortikale explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Farging Insekter for Behavioral Analyser: den Mating Behavior av bedøvd<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektro Metode for opptak Intracellulær spenningsreaksjoner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptorer og interneurons til lys stimuli<em&gt; I Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Eksempel forberedelse til Endopeptidomic analyse i menneskelig Cerebrospinalvæske

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Byggingen av en forbedret flere sperrende Hyperdrive for store nevrale opptak i oppfører seg rotter

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

I vivo Imaging av spinal Fluid transport gjennom intakt Mouse Skull bruker fluorescens Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Injeksjoner av AAV-vektorer for optogenetikk i bedøvet og våken oppfører seg ikke-menneskelig primathjerne

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

A Pilot Study on the Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation of A&#946; and Tau Levels in Rhesus Monkey Cerebrospinal Fluid

En pilotstudie om repeterende transkraniell magnetisk stimulering av Aβ- og Tau-nivåer i Rhesus Monkey Cerebrospinalvæske

Previous studies have demonstrated that a non-invasive light-flickering regime and auditory tone stimulation could affect A&#946; and tau metabolism in ...

Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System

Dynamisk sanntidssamling av hippocampus ekstracellulær væske fra bevisste rotter ved hjelp av et mikrodialysesystem

A variety of central nervous system (CNS) diseases are associated with changes in the composition of hippocampal extracellular fluid (HECF). However, ...