Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Nacional Natural Science Foundation da China (81650110527, 81371400) e nacional chave básica pesquisa programa de China (2013CB530900).

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as políticas da sociedade de neurociência (EUA) e comissões de ética de Fudan University (Shanghai, China). Este procedimento é para uma cirurgia não-sobrevivência.
1. instalação de aparelhos de coleção do CSF
<ol><li>Puxe o vidro capilar (diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo 1,0 mm) usando um extrator de micropipeta (conforme mostrado no Liu et al . 10; capilar afiad...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atual métodos10 da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média ~ 10-15 µ l podem ser obtidos) dos ratos. Ao quebrar a ponta capilar, a ponta do capilar não deve ser muito pequena (como então o CSF será extraído muito lentamente) ou muito grande (vontade não ser fino o suficiente para recolher o CSF e tecido pode tornar-se alojou no capilar). Tenha cuidado quand...

O CSF é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. O CSF é feito principalmente do plasma sanguíneo, que contém poucas células (sem células vermelhas do sangue e apenas algumas células brancas do sangue) e é quase livre de proteína. É um dos fluidos em contato próximo com o sistema nervoso central (SNC) e pode passar muitos eletrólitos para fora do cérebro e da medula espinhal para o sistema periférico. Em humanos, CSF amostras podem ser coletadas para auxiliar no diagnóstico de doenças ou para fins de pesquisa em ensaios clínicos, como uma punção (ou punção lombar) é um procedimento invasivo, menor: o fluido CSF pode refletir as alterações no SNC sem ter que acessar diretamente estas tecidos. Assim, nos últimos anos, para fins de pesquisa, na clínica, amostras de CSF foram obtidas de pacientes de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer e outras demências1,2,3. Existem muitos ensaios de biomarcador que foram desenvolvidos usando amostras do CSF para potencialmente auxiliar no diagnóstico de doenças na clínica2,3. No entanto, existe muito debate sobre a fiabilidade destes ensaios para produzir resultados consistentes, sensíveis para diagnosticar especificamente doença4,5. Então, há uma grande necessidade para o desenvolvimento de melhores ensaios e alvos, que podem ser encontrados no CSF, para auxiliar na produção de uma norma técnica para diagnosticar doenças neurodegenerativas com maior sensibilidade e especificidade. Devido a importância potencial das amostras de CSF humanas na doença, a coleção de LCR de roedores em pesquisas de Neurociências também é de interesse.
Ratos são animais importantes em pesquisas biológicas e médicas e permitam o teste de potenciais compostos terapêuticos e estudos de prova de conceito antes de testes clínicos em humanos. No entanto, em camundongos é difícil obter amostras CSF devido a sua proximidade ao cérebro de um animal pequeno, como o método usual de coleção do CSF em camundongos é obtê-la através da cisterna magna, uma abertura entre o cerebelo e a superfície dorsal da medulla oblongata. Isso faz com que a dificuldade na coleta de amostras de CSF nesta área é difícil de dissecar a e na proximidade de vasos sanguíneos, aumentando o risco de contaminação das células do sangue. Devido a essas dificuldades, a maioria dos pesquisadores só podem obter uma pequena quantidade de LCR para análise (geralmente indicado como 5 a 7 µ l) e a contaminação das amostras do CSF por pilhas de sangue é uma preocupação primordial para análises6,7,8 , 9. contaminação de sangue pode obscurecer os resultados e não realmente refletem o estado do SNC. Além disso, amostra limitada coletada pode afetar a pesquisa como a quantidade habitual coletada de ratos é suficiente para apenas uma medição (em duplicado ou triplicado) utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Assim, amostras de CSF são geralmente agrupadas de vários mouses para ter suficiente amostra para executar vários ensaios. Desenvolver um protocolo para a abundante, coleção incontaminada de LCR de ratos é muito desejada e será benéfica na melhoria da investigação neurociência usando roedores.
Neste protocolo, uma técnica para a abundante (uma média de 10-15 µ l) coleção de LCR de ratos anestesiados é descrita em detalhes e melhora em um método atualmente conhecido da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue10. Um protocolo robusto para coleção CSF ajudarão no desenvolvimento dos ensaios baseados em CSF biomarcador, que poderia ser usado para auxiliar no diagnóstico de doenças, bem como melhorar a pesquisa para os mecanismos subjacentes a doenças que afectam o CNS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. É um dos fluidos em contato mais próximo com o sistema nervoso central e assim, pode ser usado para analisar o estado doente do cérebro ou da medula espinhal sem acessar diretamente esses tecidos. No entanto, em ratos, é difícil de obter da cisterna magna devido a sua proximidade de vasos sanguíneos, que muitas vezes contaminar amostras. A área para a coleção do CSF em ratos também é difícil de dissecar a e muitas vezes apenas pequenas amostras são obtidas (máximo de 5 a 7 µ l ou menos). Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atuais métodos de coleção para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média que 10-15 µ l podem ser coletados). Esta técnica pode ser usada com outros métodos de dissecação na recolha de tecidos de ratos, como isso não afeta quaisquer tecidos durante a extração do CSF. Assim, o cérebro e a medula espinhal não são afetados com esta técnica e permanecem intactos. Com a maior coleção de amostra do CSF e pureza, mais análises podem ser usadas com esta pesquisa de neurociência do fluido para mais ajuda e entendem melhor as doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Usando o procedimento descrito aqui (Figura 1 e Figura 2), o CSF imediatamente recolhido no capilar deve ser clara (Figura 2E), não rosa ou vermelho. Se houver uma rosa para coloração avermelhada para o fluido coletado no capilar, depois houve contaminação com sangue.
Como um exemplo da aplicação da amostra do CSF coletados com esse ...

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An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Este protocolo descreve uma técnica melhorada para a coleção abundante de líquido cerebrospinal (CSF), sem contaminação de sangue. Com a maior coleção de amostra e pureza, mais análises podem ser executadas usando o CSF para aprofundar nossa compreensão das doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Percussão Fluid lateral: Modelo de Lesão em Ratos

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Neurociência

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

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Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Preparação da amostra para análise de Endopeptidomic no líquido cefalorraquidiano humano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Construção de um Hyperdrive melhorado de multi Tetrode para gravação Neural em grande escala em comportar-se ratos

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A variety of central nervous system (CNS) diseases are associated with changes in the composition of hippocampal extracellular fluid (HECF). However, ...