Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81650110527, 81371400) y nacional clave básica de investigación programa de China (2013CB530900).

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las políticas de la sociedad para la neurociencia (USA) y comités de ética de la Universidad de Fudan (Shanghai, China). Este procedimiento es una cirugía no supervivencia.
1. instalación de aparatos de la colección de LCR
<ol><li>Tire el vaso capilar (diámetro interno 0, 75 mm, diámetro externo de 1,0 mm) utilizando un extractor de micropipeta (como se muestra en Liu et al. 10; tubo capilar...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora las actuales métodos10 de recolección de LCR para minimizar la contaminación de la sangre y permitir la abundante colección de LCR (promedio ~ 10-15 μl pueden obtenerse) de ratones. Al romper la punta del capilar, la punta del tubo capilar no debe ser demasiado pequeña (como el LCR se extraerán muy lentamente) o demasiado grandes (no ser fina suficiente para recoger el LCR y tejido puede alojarse en el capilar). Debe tenerse cui...

El LCR es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. El LCR se hace principalmente de plasma de sangre, que contiene pocas células (sin glóbulos rojos y sólo unas pocas células blancas de la sangre) y está casi libre de proteínas. Es uno de los fluidos en contacto con el sistema nervioso central (SNC) y puede pasar muchos electrolitos del cerebro y la médula espinal del sistema periférico. En los seres humanos, CSF muestras se pueden recoger para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad o para fines de investigación en ensayos clínicos, como una punción raquídea (punción lumbar) es un procedimiento invasivo, menor: el líquido cefalorraquídeo puede reflejar los cambios en el SNC sin tener que acceder directamente a estos tejidos. Así, en los últimos años, para fines de investigación en la clínica, se han obtenido muestras de CSF de pacientes de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y otras demencias1,2,3. Hay muchos análisis de biomarcadores que se han desarrollado utilizando muestras de CSF para potencialmente ayudar en el diagnóstico de enfermedades en la clínica2,3. Sin embargo, hay mucho debate sobre la fiabilidad de estos ensayos para producir resultados consistentes y sensibles para diagnosticar específicamente la enfermedad4,5. Por lo tanto, hay una gran necesidad para el desarrollo de mejores ensayos y objetivos, que pueden encontrarse en el líquido cefalorraquídeo, para ayudar en la producción de una técnica estándar para diagnosticar enfermedades neurodegenerativas con mayor sensibilidad y especificidad. Debido a la importancia potencial de muestras humanas de la CSF en la enfermedad, la colección del LCR de los roedores en la investigación de la neurociencia es también de interés.
Ratones son animales importantes en la investigación biológica y médica y permiten la prueba de potenciales compuestos terapéuticos y estudios de prueba de concepto antes de ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, en ratones es difícil obtener muestras CSF debido a su proximidad al cerebro en un animal pequeño, como el método de recolección de LCR en ratones es obtenerlo a través de la cisterna magna, una abertura entre el cerebelo y la superficie dorsal de la médula oblongada. Esto causa dificultad en la recolección de muestras de CSF como esta área es difícil de diseccionar a y en proximidad cercana a los vasos sanguíneos, aumentando el riesgo de contaminación de las células de la sangre. Debido a estas dificultades, la mayoría de los investigadores sólo puede obtener una pequeña cantidad de LCR para análisis (generalmente indicado como μl 5-7) y la contaminación de muestras de CSF en las células de la sangre es una preocupación primaria para análisis6,7,8 , 9. contaminación de la sangre puede ocultar resultados y no verdaderamente reflejan el estado del SNC. Además, muestra limitada recogida puede impacto investigación como en la cantidad habitual de ratones es suficiente sólo una medición (en duplicado o triplicado) usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Así, muestras CSF son agrupadas generalmente de varios ratones con el fin de tener suficiente muestra para ejecutar múltiples ensayos. Desarrollando un protocolo para la abundante, colección incontaminada de la CFS de ratones se desea grandemente y será beneficiosa en la mejora de la investigación de la neurociencia con roedores.
En el presente Protocolo, una técnica para la abundante (un promedio de 10-15 μl) colección de LCR de ratones anestesiados se describe en detalle y mejora en un método actualmente conocido de recolección de LCR para minimizar la contaminación de sangre10. Un protocolo robusto para recolección de LCR ayudará en el desarrollo de análisis de biomarcadores basados en la CSF, que podría utilizarse para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad, así como mejorar la investigación en los mecanismos que subyacen a las enfermedades que afectan el SNC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

El líquido cerebroespinal (CFS) es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. Es uno de los fluidos en contacto más cercano con el sistema nervioso central y por lo tanto, se puede utilizar para analizar el estado enfermo del cerebro o la médula espinal sin acceder directamente a estos tejidos. Sin embargo, en los ratones es difícil de obtener de la cisterna magna debido a su proximidad a los vasos sanguíneos, que a menudo contaminan las muestras. El área de recolección de LCR en ratones también es difícil de diseccionar a y a menudo sólo pequeñas muestras se obtienen (máximo de 5-7 μl o menos). Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora en los métodos actuales de colección para minimizar la contaminación de la sangre y permiten la abundante colección de LCR (en promedio que 10-15 μl se pueden recoger). Esta técnica puede utilizarse con otros métodos de disección para la colección de tejidos de ratones, como no afecta ninguna tejidos durante la extracción de la CSF. Así, el cerebro y la médula espinal no se ven afectadas con esta técnica y permanecen intactos. Con pureza y una mayor recolección de muestra de LCR, análisis más pueden utilizarse con esta investigación de la neurociencia de líquido para más ayuda y entienden mejor las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

Utilizando el procedimiento descrito aquí (figura 1 y figura 2), el CSF recogido inmediatamente en el tubo capilar debe ser claro (Figura 2E), no color de rosa o rojo. Si hay un color de rosa a la tonalidad rojiza al líquido en el capilar, luego hubo contaminación con sangre.
Como un ejemplo de la aplicación de la muestra de LCR obtenid...

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An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Este protocolo describe una técnica mejorada para la abundante colección de líquido cefalorraquídeo (LCR) sin contaminación de la sangre. Con la mayor colección de la muestra y la pureza, se pueden realizar análisis más uso de CSF para mejorar nuestra comprensión de las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

Research

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Neuroscience

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