Name: an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation Kina (81650110527, 81371400) och nationella nyckel grundläggande forskning Program av Kina (2013CB530900).

Alla djurförsök har utförts i enlighet med politiken av samhället för neurovetenskap (USA) och Fudan University (Shanghai, Kina) etiska kommittéer. Detta förfarande är för en icke-survival kirurgi.
1. inställning av CSF samling apparater
<ol><li>Dra av glaset kapillär (innerdiameter 0,75 mm, yttre diameter 1,0 mm) med en mikropipett avdragare (enligt Liu et al. 10. vässade kapillär visas i figur 1).</li>
	<li>Plats e...

<ol>
	<li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+Biomarkers+for+Alzheimer's+Disease+Diagnosis.">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort.">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li><li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer's+disease+diagnosis:+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer's+Biomarkers+Standardization+Initiative.">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li><li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarkers+of+Alzheimer's+disease:+impact+on+disease+concept,+diagnosis,+and+clinical+trial+design.">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS.">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li><li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+observation+on+CSF+A&#946;42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein/presenilin-1+doubly+transgenic+mice.">Longitudinal observation on CSF A&#946;42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li><li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition.">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li><li>You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid.">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse.">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li><li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+amyloid-&#946;+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein.">Changes in amyloid-&#946; and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).</li><li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1.">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li></ol>

Detta protokoll i detalj beskriver en teknik som förbättrar den nuvarande metoder10 av CSF samling att minimera kontaminering från blod och tillåta för riklig insamling av CSF (i genomsnitt ~ 10-15 µL kan erhållas) från möss. När du bryter kapillär spetsen, spetsen av kapillären inte bör vara för liten (som då GSR extraheras mycket långsamt) eller för stor (kommer inte är fina nog att samla GSR och vävnad kan fastna i kapillären). Försiktighet bör iakttas när dissekera områ...

CSF är en värdefull kroppen vätska för analys i neurovetenskap forskning. CSF är huvudsakligen tillverkade av blodplasma, som innehåller några celler (inga röda blodkroppar och endast några vita blodkroppar) och är nästan fritt från protein. Det är en av vätskorna i nära kontakt med det centrala nervsystemet (CNS) och det kan passera många elektrolyter från hjärnan och ryggmärgen till perifera systemet. I människor, CSF prover kan samlas till stöd i diagnos av sjukdom eller för forskningsändamål i kliniska prövningar, som spinal tap (eller lumbalpunktion) är en mindre, invasiv procedur: CSF vätskan kan återspegla förändringar i CNS utan att direkt få tillgång till dessa vävnaderna. Således, under de senaste åren, för forskningsändamål i kliniken, CSF prover har erhållits från patienter med neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom och andra demenssjukdomar1,2,3. I området i närheten finns det många biomarkör-analyser som har utvecklats med hjälp av CSF prover till potentiellt stöd för att diagnostisera sjukdomar i klinik2,3. Det finns dock mycket debatt om tillförlitligheten av dessa analyser att producera konsekventa och känsliga resultat för att specifikt diagnostisera sjukdom4,5. Så, finns det ett stort behov för utveckling av bättre analyser och mål, som kan hittas i CSF, till stöd i att producera en standardiserad teknik att diagnostisera neurodegenerativa sjukdomar med större känslighet och specificitet. På grund av den potentiella betydelsen av mänskliga CSF prover vid sjukdom är insamling av CSF från gnagare i neurovetenskap forskning också av intresse.
Möss är viktiga djur i biologisk och medicinsk forskning och möjliggör testning av potentiella terapeutiska föreningar och proof-of-concept studier innan kliniska prövningar. Hos möss är det dock svårt att erhålla CSF prover på grund av dess närhet till hjärnan i ett litet djur, som den vanliga metoden för CSF insamling hos möss är att få det via cisterna magna, en öppning mellan lillhjärnan och dorsala ytan av förlängda märgen. Detta medför svårigheter att samla in CSF prover eftersom detta område är svårt att dissekera till och i nära närhet till blodkärlen, ökar risken för kontaminering från blodkroppar. På grund av dessa svårigheter, de flesta forskare kan endast få en liten mängd av CSF för analys (oftast anges som 5-7 µL) och kontaminering av CSF prover av blodkroppar är en huvudfråga för analyser6,7,8 , 9. blod kontaminering kan skymma resultat och inte verkligen återspeglar tillståndet i CNS. Dessutom begränsat urvalet samlat kan påverka forskning som den vanliga mängden insamlade från möss är nog för endast en mätning (i två eller tre exemplar) använder enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Således, sammanförs vanligtvis CSF prover från flera möss för att ha tillräckligt prov köra flera analyser. Utveckla ett protokoll för den rikliga, oförorenad samling av CSF från möss önskas kraftigt och kommer att vara fördelaktigt att förbättra neurovetenskapliga forskning med hjälp av gnagare.
I detta protokoll, en teknik för den rikliga (ett genomsnitt på 10-15 µL) samling av CSF från sövda möss beskrivs i detalj och förbättrar en nu kända metoden för CSF insamling att minimera kontaminering från blod10. Ett robust protokoll för CSF samling kommer stöd i utvecklingen av CSF-baserade biomarkör analyser, som skulle kunna användas till stöd för att diagnostisera sjukdomen, samt förbättra forskningen till de mekanismer som ligger bakom sjukdomar som drabbar CNS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate (used as anesthetic)</td>
			<td>Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.</td>
			<td>30037517</td>
			<td>CAS number 302-17-0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>54002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting curved forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting straight forceps</td>
			<td>66 vision technology</td>
			<td>53070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adapter (with ear bars)</td>
			<td>Made in-house.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Similar equipment available from World Precision Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Meiji Labax</td>
			<td>Model 15381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base for micromanipulator</td>
			<td>Kanetec</td>
			<td>MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>02024692</td>
			<td>For 1ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.5ml)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human A&#946;42 ELISA kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KHB3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piping (teflon tubing)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMP-KIT</td>
			<td>Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Tiangen Biotech</td>
			<td>OSE-MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Obtained from any household store/pharmacy.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice

Cerebrospinalvätska (CSF) är en värdefull kroppen vätska för analys i neurovetenskap forskning. Det är en av vätskorna i närmaste kontakt med centrala nervsystemet och således kan användas för att analysera tillståndet sjuka i hjärnan eller ryggmärgen utan direkt tillgång till dessa vävnader. Dock i möss är det svårt att få från cisterna magna på grund av dess närhet till blodkärlen, vilket ofta förorena prover. Området för CSF samling hos möss är också svårt att dissekera till och ofta endast små prover erhålls (maximalt 5-7 µL eller mindre). Detta protokoll beskriver i detalj en teknik som förbättrar den nuvarande metoder för att minimera kontaminering från blod och tillåta för riklig insamling av CSF (i genomsnitt 10-15 µL kan samlas). Denna teknik kan användas med andra dissektion metoder för insamling av vävnad från möss, eftersom det inte inverkar alla vävnader under CSF extraktion. Således, hjärnan och ryggmärgen påverkas inte med denna teknik och förbli intakt. Med större CSF-provtagning och renhet, fler analyser kan användas med denna vätska att ytterligare stöd neurovetenskapliga forskning och bättre förstå sjukdomar som drabbar hjärnan och ryggmärgen.

Med hjälp av proceduren som beskrivs här (figur 1 och figur 2), bör CSF omedelbart samlas in i kapillären vara tydlig (figur 2E), inte rosa eller röd. Om det finns en rosa till röd nyans till vätska som samlas in i kapillären, då fanns det kontaminering med blod.
Som ett exempel på tillämpningen av CSF provet samlas in med denna ...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice at JoVE.com

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Det här protokollet beskriver en förbättrad teknik för riklig insamling av cerebrospinalvätska (CSF) med ingen förorening från blodet. Med större provsamling och renhet, kan fler analyser utföras med CSF för att vidareutveckla vår förståelse av sjukdomar som påverkar hjärnan och ryggmärgen.

En förbättrad metod för insamling av ryggmärgsvätska från sövda möss

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

The overall goal of this procedure is to improve collection of cerebrospinal fluid from mice without contamination from blood. This method provides an easy and reliable way to collect CSF for monitoring the biomarkers of neural diseases. The main advantage of this technique is that the addition with the micromanipulator to aid in CSF collection from mice decreases the contamination of blood during collection.Begin by placing a pulled glass capillary into a capillary holder which is firmly mounted on a micromanipulator. Next, while viewing through a dissecting microscope, use straight forceps to break the tip of the sharpened capillary so that the inner diameter of the broken tip is about 10 to 20 microns. Then attach a thin tube and a syringe to the other end of the capillary holder, connect the thin tube and the syringe with a three-way valve and shift the three-way valve to open.Then plunge the syringe to expel any contaminants and create positive pressure in the capillary tube. Repeat this a few times by disconnecting and reconnecting the syringe to the three-way valve. Then draw up air to 100 to 200 microliters before the final reconnection of the syringe with the three-way valve.Move the micromanipulator with the glass capillary to the side to prevent damage during the surgical procedure. Before beginning the surgery, ensure that the mouse has been fully anesthetized by pinching all four limbs and observing the absence of a reaction. Then use dissecting scissors to cut and trim the hair at the back of the head of the mouse from above the eyes between the ears to the bottom of the neck.Secure the head of the mouse using a stereotaxic frame mouse adapter. Make sure the head cannot move and is secured tightly in the adapter by gently pushing down onto the head of the mouse. Use scissors and curved forceps to cut through the mouse skin across the back of the neck and then down the middle of the skull between the ears and eyes of the mouse.Pull the skin and tissue apart and out of the area over the cisterna magna. While viewing through the dissecting microscope, carefully dissect away the last thin layers of muscle over the base of the skull using forceps and move these layers of muscle to the side and out of the area of interest. Once the dura over the cisterna magna is exposed, use a wet cotton bud to wipe the membrane clean and then use a dry cotton bud to dry the area.The cisterna magna appears triangular with one to two large blood vessels running through the area. Either side of or between the blood vessels is optimal for capillary insertion and CSF collection. Once the cisterna magna is exposed, use the micromanipulator to align the glass capillary to the back of the mouse head so that the sharpened point is just behind the membrane at a 30 to 45 degree angle.Next, plunge the syringe once or a few times and then move the plunger back 100 to 200 microliters to make sure there are no contaminants and there is negative pressure in the glass capillary. Then move the capillary tip closer to the membrane until resistance can be seen, but without puncturing the membrane. Knock on the micromanipulator controls to gently tap the capillary tube through the membrane.CSF should automatically be drawn into the capillary tube once the opening has been punctured. Leave the capillary in place to slowly collect CSF. If the CSF has stopped flowing, slowly draw the syringe up approximately 50 microliters to create more negative pressure in the capillary.Ten to 15 microliters of CSF is collected in 10 to 30 minutes. Once the desired volume of CSF has been collected, close the tubing by shifting the three-way valve to close and remove the syringe connected to the tubing. Open and then close the tubing to create equalized pressure in the capillary, the tubing, and the area outside the capillary.Then reconnect the syringe before gently removing the glass capillary from the mouse using micromanipulator. Next, place the collection tube containing one microliter of 20X protease inhibitor under the sharpened point of the glass capillary. Open the tubing and gently plunge the syringe.The CSF should flow out of the capillary and into the collection tube. After collection, pulse centrifuge the CSF to mix the sample with the protease inhibitor at the bottom of the collection tube. CSF samples can be aliquoted and then stored for further analysis at minus 80 degrees Celsius.CSF collected from APP/PS1 mice demonstrated a significant increase in levels of human A beta 42 at 12 months of age. In wild type mice, no human A beta 42 was detected. Once mastered, this procedure can be done in one hour if performed properly.While attempting this procedure, it is important to remember to avoid blood vessels when inserting the capillary and to only make minor adjustments with the micromanipulator during CSF collection to avoid contamination with blood.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Lateral Fluid slagverk: Modell av traumatisk hjärnskada hos möss

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering av cerebrospinalvätska från Gnagare Embryon för användning med Dissekerade cerebrala kortikala Explantat

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Färgning Insekter för Behavioral Analyser: den parningsbeteende hos bedövade<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektro Metod för inspelning Intracellulärt Spännings svar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorer och Intern på ljusstimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Provberedning för analys av Endopeptidomic i mänskliga cerebrospinalvätska

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Byggandet av en förbättrad multi tetrod Hyperdrive för storskaliga neurala inspelning i beter sig råttor

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In vivo avbildning av cerebrospinalvätska transport genom intakt mus skalle med Fluorescensmakroskopi

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Injektioner av AAV-vektorer för optogenetik i bedövad och vaken beteende icke-mänsklig primathjärna

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

A Pilot Study on the Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation of A&#946; and Tau Levels in Rhesus Monkey Cerebrospinal Fluid

En pilotstudie om repetitiv transkraniell magnetisk stimulering av Aβ- och Tau-nivåer i Rhesus Monkey Cerebrospinal Fluid

Previous studies have demonstrated that a non-invasive light-flickering regime and auditory tone stimulation could affect A&#946; and tau metabolism in ...

Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System

Dynamisk insamling i realtid av hippocampus extracellulär vätska från medvetna råttor med hjälp av ett mikrodialyssystem

A variety of central nervous system (CNS) diseases are associated with changes in the composition of hippocampal extracellular fluid (HECF). However, ...