Name: two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회, 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC 발견 부여)와 사 보이 재단에 의해 지원 되었다. OC에서 NSERC 박사 장학금에 의해 지원 되었다.

모든 실험 동물 보호 위원회 대학교 발 및 동물 관리에 캐나다 위원회의 동물 복지 지침에 따라 수행 했다.
1. 사전 준비 (선택 사항: 1 일을 사전에 준비)
<ol><li>세 가지 유형의 인공 척수 (실제) 솔루션 (일반, 자당 및 복구 솔루션, 1 L 각; 표 1참조)를 준비 합니다. 300 ± 10 mOsm25 솔루션의 osmolality 조정 하 고 실제 자당 근처 빙 점 아래로 냉각 (0-4 ° ...

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

여기에 나와 있는 메서드는 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 신호 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학의 결합을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 메서드는 두는 로컬 Ca2 + 고도 전기 자극 또는 backpropagating AP 수지상 세그먼트, 및 세포의 체세포 응답에 의해 evoked의 모니터링에 대 한 수 있습니다. 이렇게 하면 수지상 나무의 ?...

뉴런 네트워크 활동의 기여는 주로 수신 시 냅 시스 입력의 동적 특성에 의해 결정 됩니다. 전통적으로, 신경 세포에 시 냅 스 활동을 특성화의 주된 방법 postsynaptic 전류 통로의 축 삭의 전기 자극에 의해 evoked의 체세포 전체 셀 패치 클램프 기록에 의존. 그러나,이 경우1사실 proximally 있는 시 냅 스의 유일한 활동 보고 됩니다. 또한, 시 냅 스 특정 메커니즘을 평가, 녹음 및 특정 위치에 모 수석 신경의 쌍에서 각각의 시 냅 스 및 수지상 통합의 메커니즘을 대상으로 사용 되었습니다. 시 냅 스 생리학의 분야에서 중요 한 돌파구는 광학 및 electrophysiological 기법의 결혼을 통해 달성 되었다. 2 광자 여기 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2PLSM) Ca2 + 이미징 및 optogenetic 도구와 함께 뇌 조각 에서에서 특정 신경 연결에 시 냅 시스 활동의 동적 조직의 엄청난 정보를 계시 할 수 있다 체 외 그리고 vivo에서.
몇 가지 주요 장점 만든 2PLSM 기존의 한 광자 여기 현미경2에서 밖으로 서: (1)의 2 광자 여기 비선형 특성상 형광 초점 볼륨에만 생성 되 고 모든 내보낸된 광자 대표 유용한 신호 (pinhole에 대 한 필요는 없음); (2) 긴 파장, 2PLSM, 사용 침투 분산 조직을 보다 효율적으로; 또한, 흩어져 광자는 2 광자 여기 및 배경 형광; 너무 희석 (3) photodamage 및 phototoxicity 초점 평면으로 제한 됩니다. 따라서, 기존의 confocal 현미경에 비해 2 광자 시스템의 높은 비용에도 불구 하 고는 2PLSM 신경 구조와 기능 두꺼운 살아있는 조직에서의 고해상도 조사 방법의 선택에 남아 있다.
분산 조직에서 2PLSM의 첫 번째 응용 프로그램 구조와 기능 수지상 쪽이3의 이미지를 했다. 캘리포니아2 + 이미지와 함께에서 2PLSM 고립 된 생 화 확 적인 격실으로 그 쪽이 기능을 공개 했다. 두 광자 캘리포니아2 + 곧 이미징 되었다 유용한 도구 그대로 조직5, 개별 시 냅 스의 활동을 보고 많은 신경 종류에 등뼈와 개별 시 냅 스4사이의 일대일 대응 관계입니다, 6,,78. 또한, 2PLSM 기반 Ca2 + 이미징 성공적으로 사용한 단일 칼슘 채널 및 기본 및 시 냅 스 conductances 사이 비선형 상호 작용의 활동을 모니터링 하로 평가 하는 상태 및 활동 의존 하 규칙의 캘리포니아2 + 신경 dendrites5,6,7,8,9,,1011에 신호.
칼슘은 유비 쿼터 스 세포내 두번째 메신저, 그리고 그것의 subcellular spatiotemporal 조직 이온의 레 귤 레이 션을 시 냅 스 강도에 따른 생리 적 반응의 방향을 결정 합니다 채널, 모 수석 등뼈 성장으로 뿐만 아니라 세포 죽음 및 생존 수지상 캘리포니아2 + 고도 여러 통로의 활성화를 통해 발생합니다. 활동 전위 (APs), 모 수석에 backpropagating 전압 개폐 칼슘 채널12 열고 dendrites와 쪽이13에 상대적으로 글로벌 캘리포니아2 + 과도 (고양이)를 생성 합니다. 시 냅 스 전송 postsynaptic 캘리포니아2 +의 활성화와 관련 된-투과 수용 체 (NMDA, 캘리포니아2 +-침투성 AMPA와 kainate),6,,1415고양이 시 냅 스 트리거링. 마지막으로, 특정 조건11,12,,1316에서 모 수석에 supralinear Ca2 + 이벤트를 생성할 수 있습니다.
두 광자 캘리포니아2 + 영상 패치 클램프 electrophysiological 녹음와 함께에서 사용 하 여 합성 캘리포니아2 +-전체 셀 녹음 중 패치 전극을 통해 일반적으로 배달 민감한 형광 표시기 . 캘리포니아2 + 역학의 정량화에 대 한 표준 방법 듀얼 표시기 방법17,18을 기반으로 합니다. 두 fluorophores 잘 분리 된 방출 스펙트럼을 사용 하 여 (예를 들어, 빨간색 캘리포니아2 +의 조합-녹색 Ca2 + 지표, 오 레 곤 그린 BAPTA-1 또는 Fluo-4 등을 구분 하지 않는 염료)에 비해 몇 가지 장점이 고는 단일 표시 방법입니다. 첫째, 캘리포니아2 +-구분 염료는 캘리포니아2 + 이미징 수행할 수 관심 (수지상 지점과 쪽이)의 작은 구조를 찾는 데 사용 됩니다. 둘째, 녹색과 적색 형광 (ΔG/R)에 있는 변화 사이 비율 측정 [캘리포니아2 +], [캘리포니아2 +]017 에서 변동으로 인해 초기 형광의 변화에 크게 민감한은으로 계산 됩니다. , 18. 또한, 형광 변경 절대 캘리포니아2 + 농도19의 점에서 측정 될 수 있다.
급성 조각에서 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 실험을 실행 하는 때 일반적인 관심사 셀 건강 및 일반적으로 사용 하는 높은 레이저 전원 인해 이미지 수집의 안정성 이다. 또한, 캘리포니아2 + 이미징 실험, 거기에서는 섭 동 및 subcellular 캘리포니아2 + 역학의 실질적인 과대평가 대 한 우려 사실은 캘리포니아2 + 지표 역할 높은 모바일 exogenous 캘리포니아2 + 완충기입니다. 따라서, 실험 질문 및 신경 유형, 고양이의 예상된 진폭에 따라 Ca2 + 표시기와 그것의 농도의 선택 합니다.
우리는 캘리포니아2 + 변동 GABAergic 수9,,1011,,2021 의 dendrites의 조사를 위해 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 방법 적응 , 22. 초기 캘리포니아2 + 이미징 연구의 대량 주 신경에서 수행 했다, 금지 수 피라미드 세포20 에 그 고유 기능 캘리포니아2 + 메커니즘의 큰 다양 한 쇼케이스 , 23 , 24. 이러한 interneuron 관련 메커니즘 (예:, 캘리포니아2 + 침투성 AMPA 수용 체) 세포 활동을 조절에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. 수지상 캘리포니아2 + 수에서 신호는 추가 조사에 대 한 유혹 대상, 하는 동안 2 광자 캘리포니아2 + 모 수석 세포 이미징 과제가 추가, 모 수석의 더 얇은 직경을 등뼈의 부족에서 특히 높은 생 캘리포니아2 + 바인딩 용량. 우리의 연구 관심 hippocampal 수의 연구에 초점, 다음 프로토콜 다른 신경 인구에 적용 하는 동안 했다 그 문제를 다루는 적응.
이 프로토콜은 상업 confocal 2 광자 현미경, 2 개의 외부, descanned 비 감지기 (NDDs), 전기 광학 변조기 (엄), 및 Dodt 그라데이션 대비 (SGC), 스캔 광학 테이블에 설치는 처형 되었다. 현미경 모드 잠겨 800 Ti:Sapphire multiphoton 레이저와 결합 되었다 (> 3 W, 140 fs 펄스, 80 Hz 반복 속도) nm. 이미징 시스템 온도 제어, 2 개의 micromanipulators와 번역 플랫폼, 컴퓨터 제어 microelectrode 앰프, 디지타이저,는 자극 관류 챔버를 포함 하 여 표준 전기 생리학 장비를 장착 했다 단위, 및 데이터 수집 소프트웨어

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Animal Strain: Mouse CD1&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Charles River</td>
			<td style="width:159px;">022</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:148px;">AbbVie Corporation</td>
			<td>0B506-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CGP 55845 hydrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium gluconate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Sodium phosphate monobasic 
			monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">A10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">SR95531 (Gabazine)&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Abcam</td>
			<td style="width:159px;">ab120042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:239px;"> 
			Guanosine (GTP)-Na+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Oregon Green BAPTA-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Streptavidin-conjugated Alexa-546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Patch Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Theta Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BT-150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&#160;</td>
			<td>Coherent</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">LAS AF Imaging Acquisition Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Temperature Controller TC-324B</td>
			<td style="width:148px;">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Digidata 1440A Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Confocal Translator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			pClamp Data Acquisition Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			A365 Constant Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:148px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Vibraplane Optical Table</td>
			<td style="width:148px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

칼슘 (캘리포니아2 +) 이미징 신경 모 수석에 세포내 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 역학 조사 하는 강력한 도구입니다. 캘리포니아2 + 변동 막과 세포내 메커니즘의 다양 한 통해 발생 하 고 시 냅 스가 소성의 유도 및 수지상 흥분의 규칙에 중요 한 역할을 담당할 수 있습니다. 따라서, 수지상 지점에서 서로 다른 유형의 Ca2 + 신호를 기록 하는 기능 모 수석 정보를 통합 하는 방법을 공부 하는 그룹에 대 한 가치가 있다. 두 광자 현미경의 출현이 했다 이러한 연구를 훨씬 쉽게 이미징 산란 등 photodamage 살아있는 조직에 내재 된 문제를 해결 하 여. 또한, 기존의 electrophysiological 기법 2 광자 캘리포니아2 + 이미지의 조합를 통해 수는 로컬 Ca2 + 변동에 녹음과 동시에 신경 모 수석에서 시 냅 스 활동의 조사 소마입니다. 여기, 우리가 GABAergic 금지 수의 dendrites에이 메서드를 사용 하 여 로컬 Ca2 + 과도 (고양이)의 역학을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에서 신경 종류에 신호에 적용할 수 있습니다.

여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 고양이 체세포 현재 분사와 해 마의 CA1 영역에서 oriens/alveus 수의 모 수석에 전기 자극을 갖는 얻은. 여러 점에서 근 모 수석에 걸쳐 linescans 획득 후에 그것의 모양 및 위치에 따라 식별 신경, 패치, 소마 (그림 1A)에서 거리에 주어진. 우리 고양이 소마 증가 (감소 AP 진폭 또는 칼슘 채널 유통, <strong class="xfig"...

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Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

The overall goal of this experiment is to study calcium elevations in neuronal dendrites in response to different stimulation paradigms using whole-cell patch-clamp recordings in neuronal soma in parallel with two-photon calcium imaging in dendrites. This method can be employed to monitor calcium signaling in small dendritic compartments, allowing for close observation of the processes that occurs in dendritic branches during integration of synaptic inputs. The main advantage of this technique is that it enables calcium signaling patterns to be observed in high spatiotemporal resolution and specificity.Place the mouse brain onto a Petri dish containing continuously oxygenated, cold ACSF-sucrose. To prepare hippocampal slices from the extracted brain, let the brain chill for around two minutes. Afterward, place a piece of filter paper on an ice-packed Petri dish, and transfer the brain onto the filter paper.Then, dissect the brain into two hemispheres. Glue the dissected hemispheres onto a vibratome sectioning platform, and immerse it into the sectioning tray filled with ice-cold oxygenated ACSF-sucrose. Subsequently, section 300-micrometer-thick slices at one degree Celsius using a vibratome cooler or placing the ice around the vibratome tray.Using a paint brush, transfer the slices containing the hippocampus to a bath of oxygenated ACSF-recovery heated to 37 degrees Celsius. In this step, transfer a hippocampal slice to a bath under the objective of a laser-scanning two-photon microscope. Continuously perfuse the bath with oxygenated ACSF-normal.Then, use infrared differential interference contrast microscopy to locate a cell of interest using its size, shape, and position. After that, fill a stimulating pipette with an ACSF-normal solution containing the red fluorophore. Lower it on top of the slice so that the tip is in the same region as the cell of interest.Following that, fill the patch pipette with patch solution, and attach it to the head stage. Set it over the slice so that its tip is directly above the cell of interest. Subsequently, fit a syringe into the three-way stopcock, and connect it to the patch pipette through a plastic tube.Inject constant positive pressure into the patch pipette, and keep the stopcock in close position. Next, open the MultiClamp amplifier control software module, and switch to Voltage Clamp mode by clicking on the VC button. Open the electrophysiology Clampex data acquisition software for recording electrophysiological signals, and click on the Membrane Test icon to send out a constant square voltage pulse for monitoring changes in the pipette resistance.Now, lower the patch pipette until it is right on top of the targeted cell. Upon making contact with the cell membrane, remove the pressure by turning the stopcock into the open position. Then, apply a slight negative pressure to the patch pipette using an empty syringe fitted into the stopcock until the pipette resistance reaches one gigaohm.In the Membrane Test window of the data acquisition software, clamp the cell at negative 60 millivolts. Continue applying negative pressure until the pipette resistance drops and the whole-cell configuration is achieved. In the MultiClamp amplifier control software module, set the patch configuration to current clamp by clicking on the IC button, and record membrane properties in response to somatic injections of hyperpolarizing and depolarizing currents.Wait for at least 30 minutes for the cell to be filled with the indicators present in the patch solution. To acquire images, locate a dendrite of interest using the red fluorescence signal. Ensure a visible response by choosing a proximal dendrite shorter than 50 micrometers, as the efficiency of AP backpropagation may significantly decline with distance in GABAergic interneurons, and switch to the xt mode.With the laser intensity controllers, set the two-photon laser at a minimal power level where baseline green fluorescence is just slightly visible, to avoid phototoxicity. Subsequently, in the Clampex electrophysiology data acquisition software Protocol window and image acquisition software, create a recording trial of the desired duration containing a somatic current injection of the desired amplitude. After that, click the Start Record button, and acquire the fluorescence continuously for one to two seconds.Repeat the image acquisition three to 10 times. Wait at least 30 seconds between single scans to avoid photodamage. To record dendritic calcium transients induced by electrical stimulation, locate a dendrite of interest using the red fluorescence signal.Set the stimulating pipette on the surface of the slice above the dendrite of interest. Slowly lower the stimulation pipette 10 to 15 micrometers from the dendrite, minimizing movement to avoid disturbing the whole-cell configuration. To visualize the location of synaptic microdomains in aspiny neurons, in the image acquisition software, switch to the xt mode and position the line along the dendritic branch of interest.In the Protocol window, create a recording trial that triggers the stimulation. Using the acquisition software, scan along the dendrite continuously for one to two seconds. Repeat acquisition three to five times, waiting 30 seconds between scans to prevent photodamage.To obtain preliminary information on the cell's morphology and keep a record of the location of the stimulation pipette, acquire a Z-stack of the cell in the red channel. Using the acquisition software in xyz mode, set the upper and lower stack limits to image the entire cell with all processes included. Then, set the step size at one micrometer, and initiate the stack acquisition using the Start Record button.When the Z-stack acquisition is complete, use the Maximum Projection option in the software to superimpose all focal plans of the stack and verify the quality of acquisition. Then, slowly retract the patch pipette out of the slice. To fix the slice for post hoc morphological identification, quickly remove the slice from the bath using a paint brush, and place it between two filter papers in an ACSF-filled Petri dish.Replace ACSF with a 4%paraformaldehyde solution, and leave the dish in a four degrees Celsius overnight. In this figure, the maximum projection of a two-photon Z-stack shows a patched interneuron filled with Alexa-594. White arrowheads point to the location of axonal terminals within the pyramidal layer, suggesting the interneuron is a basket cell.This figure shows the dendritic branch near which the stimulating electrode was positioned. The dashed line shows the location of the line scan. The images here illustrate the result of a line scan in the red and green channels.The rise in green fluorescence at the time of stimulation indicates a rise in calcium concentration in that area. The images can be binned into smaller segments, allowing the analysis of the spread of the response. The traces seen here show the calcium transients elicited in different segments in response to electrical stimulation recorded at the somatic level during the imaging trial.The amplitude of the calcium transients declines with distance from the central hotspot, indicating that the response is spatially localized. Following this procedure, other methods like voltage-sensitive dye imaging or optogenetics can be performed in order to answer additional questions, like local changes in the memory potential within dendritic branches or integration of specific inputs. After watching this video, you should have a good understanding of how to monitor activity-dependent calcium fluctuations in neuronal dendrites using a combination of optophysiological techniques, which will be useful to explore the intricacies of dendritic input integration and plasticity.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

연구

신경과학

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...