Name: a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators
Uploaded: 2018-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

الكتاب يود أن يشكر إريك أفضل وشوفس جيرت للمساعدة التقنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من خلال "وفين كو" (منحة لا. PF/10/018)، صندوق voor أونديرزوك ويتينشابيليجك (فو، منح لا. G.485.08)، وفي مؤسسة دورميور فادوز.

ملاحظة: تجري جميع الخطوات الموصوفة في إطار البابين 1 و 2 تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي مجلس الوزراء.
1-صون U87. خلايا CD4.hCXCR4
<ol><li>تنمو الخلايا في قوارير الثقافة T75 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد. ملاحظة: في المختبر خلية الخط المستخدمة في هذا البروتوكول خط خلي...

<ol>
	<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+a+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: a short history.</a> Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+non-peptide+small+molecular+CXCR4+antagonists+as+anti-HIV+agents:+Recent+advances+and+future+opportunities.">Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities.</a> Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Tsou, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plerixafor:+a+review+of+its+use+in+stem-cell+mobilization+in+patients+with+lymphoma+or+multiple+myeloma.">Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma.</a> Drugs. 71, 1623-1647 (2011).</li><li>DiPersio, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+prospective+randomized+double-blind+placebo-controlled+trial+of+plerixafor+plus+granulocyte+colony-stimulating+factor+compared+with+placebo+plus+granulocyte+colony-stimulating+factor+for+autologous+stem-cell+mobilization+and+transplantation+for+patients+with+non-Hodgkin's+lymphoma.">Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).</li><li>Balabanian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+heterodimerizes+with+CXCR4+and+regulates+CXCL12-mediated+G+protein+signaling.">CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling.</a> Blood. 113, 6085-6093 (2009).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+identification+of+allosteric+modulators+of+G-protein-coupled+receptors.">Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).</li><li>Hendrix, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety,+pharmacokinetics,+and+antiviral+activity+of+AMD3100,+a+selective+CXCR4+receptor+inhibitor,+in+HIV-1+infection.">Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).</li><li>Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicyclams,+a+class+of+potent+anti-HIV+agents,+are+targeted+at+the+HIV+coreceptor+fusin/CXCR-4.">Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4.</a> Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No-wash+dyes+for+calcium+flux+measurement.">No-wash dyes for calcium flux measurement.</a> Biotechniques. 34, 164-166 (2003).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+over-expression+and+survival+in+cancer:+a+system+review+and+meta-analysis.">CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis.</a> Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activity+and+inverse+agonists+of+G+protein-coupled+receptors:+a+current+perspective.">Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective.</a> Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).</li><li>Kenakin, T., Miller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+receptors+as+shapeshifting+proteins:+the+impact+of+allosteric+modulation+and+functional+selectivity+on+new+drug+discovery.">Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).</li><li>Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+GPCRs:+a+novel+approach+for+the+treatment+of+CNS+disorders.">Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).</li><li>Burford, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+positive+allosteric+modulators+and+silent+allosteric+modulators+of+the+mu-opioid+receptor.">Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).</li><li>Bartfai, T., Wang, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+allosteric+modulators+to+peptide+GPCRs:+a+promising+class+of+drugs.">Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs.</a> Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).</li><li>Hatse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activity+of+G-protein-coupled+receptors:+cause+of+disease+and+common+property+of+wild-type+receptors.">Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).</li><li>Zhang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+that+confers+constitutive+activity+to+CXCR4+reveals+that+T140+is+an+inverse+agonist+and+that+AMD3100+and+ALX40-4C+are+weak+partial+agonists.">A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists.</a> J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).</li><li>Tamamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-molecular-weight+inhibitor+against+the+chemokine+receptor+CXCR4:+a+strong+anti-HIV+peptide+T140.">A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140.</a> Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).</li><li>Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).</li></ol>

Ca2 +-مقايسة تعبئة الموضحة هنا ثبت سابقا أن يكون أداة قيمة تحديد وتوصيف الخصوم مستقبلات استهداف CXCR417. ومع ذلك، من المتوقع أن هذا الأسلوب يمكن تطبيقها أكثر عموما على مجموعة كبيرة من جبكرس الأخرى التي تؤدي إلى Ca2 + إصدار سيتوسوليك عند انتهاء التنشيط، كما يتضح لمستقبلات ...

جبكرس هي فوق هامة عائلة الخلية البروتينات السطحية التي تنشيط إشارة توصيل الشلالات عند ملزم يجند خارج الخلية. أنها يمكن أن يتم تنشيط بمجموعة كبيرة ومتنوعة من المحفزات بما في ذلك الببتيدات، هرمونات البروتين والامينات بيوجينيك والدهون، مما يؤدي إلى بدء مسارات الإشارات داخل الخلايا المتنوعة والاستجابات البيولوجية في نهاية المطاف1،2 . وعلاوة على ذلك، جبكرس تشارك في الكثير، إذا كانت العمليات الإنمائية والفسيولوجية، وليس كلها وكثير من الأمراض البشرية ترتبط باختلال هذه العملية إشارات أو مستقبلات overexpression. جبكرس من ذلك بين الأهداف الدوائية الأكثر تم التحقق من صحتها في الطب1،3.
عادة، يبدأ سير عمل اكتشاف المخدرات GPCR فحوصات الفحص الخلوي مما يتيح تحديد هوية المركبات مثل الجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة الببتيدات التي يمكن أن تعدل من نشاط هذه العملية خاصة. في اكتشاف الأدوية GPCR توجد العديد من أنواع مختلفة من الاختبارات للبحث عن هذه المركبات، معظمها متوافقة مع حملات منتصف-للفرز الفائق. تشمل الاختبارات الأكثر استخداماً مستقبلات ملزم التجارب، والأسفار أو التﻷلؤ على أساس فحوصات الكشف عن التقلبات في مستوى ما يسمى الثانوي الرسل (مثلاً، Ca2 +, دوري الادينوسين الأدينوزين (أمبير))، المظهرية فحوصات الكشف، وتجنيد أريستين β فحوصات4. اختيار نوع معين من التحليل قد تعتمد على عوامل متعددة، ولكن يتحدد أيضا بمعرفة مسبقة بشأن خصائص GPCR معين إرسال الإشارات. مؤثر ملزمة لهذه العملية الحث على تغيير conformational تحفيز تبادل غوانيدين diphosphate (الناتج المحلي الإجمالي) لثلاثي غوانيدين (غتب) على α-وحدة فرعية البروتينات هيتيروتريميريك ز. في وقت لاحق الفرعية-أنشئαG تنأى عن وحدة فرعيةβγ ز وكل مفارز سيتم بدء مزيد من مسارات الإشارات. التحلل المائي جزيء غتب ورابطة إعادة اللاحقة من Gα-الناتج المحلي الإجمالي ومفارزβγ ز سيتم استعادة البروتين ز إلى تكيف الخاملة5،6. تعتمد على تسلسل تشابه فرعيةα G يتم تعريف أنواع مختلفة من البروتينات ز (زق، زأنا، ز، ز12/13)7. إشارات عبر Gα يعطي وحدة فرعية ترتفع إلى عدة ردود نموذجية مثل الزيادة (عن طريق زs) أو نقصان (عن طريق زأنا) إنتاج cyclic AMP و Ca2 + تعبئة داخل الخلايا (عن طريق ز)5 ،7. زβγ وحدات فرعية أيضا قادرة على حمل مسارات المستجيب داخل الخلايا. على سبيل المثال، عند تفعيل زأنا-إلى جانب جبكرس، زβγ يمكن أن تحفز مباشرة phospholipase C (PLC-β) لإنتاج اينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) الذي يقوم بتشغيل الإصدار من Ca2 + من مخازن داخل الخلايا7 . وبعد تنشيط مستقبلات، هي فوسفوريلاتيد جبكرس بهذه العملية مؤنزم (جركس) الذي يعزز التفاعل مع β-أرريستينس. ينهي ز البروتين مما يشير إلى هذه العملية ويؤدي إلى مستقبلات الحساسية والاستيعاب في نهاية المطاف. Β-أريستينس أيضا قادرة على تشكيل المجمعات الجزيئية المتعددة التي يمكن أن تؤدي إلى أخرى مما يشير إلى مسارات مستقلة من البروتين G يشير إلى8.
ضمن فصيلة مستقبلات تشيموكيني، غأنا-هو CXCR4 المقرونة هذه العملية التي أثارت الكثير من الاهتمام كهدف واعدة لاكتشاف المخدرات. نظراً لدورها الثابت كمستقبل المشارك رئيسي لفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1 ودخول الفيروس والإصابة، مركبات استهداف CXCR4 وضعت في البداية ك مرشحين العقاقير المضادة فيروس نقص المناعة البشرية9. في الآونة الأخيرة، مجموعة متزايدة من الأدلة قد أشار إلى دور هام CXCR4 في توموريجينيسيس وسرطان خبيث يجعلها هدفا علاجية جيدا تم التحقق من صحتها في علم الأورام، فضلا عن10. وأعرب عن CXCR4 هو الغاية في أكثر من عشرين من أنواع السرطان البشري وضوابط ورم الخلايا البقاء على قيد الحياة، والانتشار، والهجرة، فضلا عن الأوعية المتصلة بالورم10. CXCR4 الخصوم من فئات كيميائية مختلفة قد سبق وصف11،12، لكن فقط جزيء صغير AMD3100 معتمد حاليا للاستخدام في العيادة كعامل تعبئة خلايا الجذعية المستخدمة أثناء فترة العلاج من سرطان الغدد اللمفاوية والورم النخاعي المرضى13،14. وتجري التجارب السريرية لتقييم سلامة وفعالية من عدة الخصوم CXCR4 الأخرى في مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان، ولكن مع تركيز قوي على الأورام12. ونظرا للعديد من التطبيقات المحتملة للخصوم CXCR4، يبرر البحث عن مركبات جديدة مع تحسين خصائص الحرائك الدوائية، وتحسين التوافر البيولوجي، أو يحتمل أن تكون أقل من الآثار الجانبية.
هنا، تستخدم في المقام الأول مقايسة خلوية حركية المستندة إلى الأسفار إلى وصف الشاشة لمركبات قادرة على تثبيط CXCR4. نيون قياس هذا الأسلوب يستند إلى زيادة عابرة داخل الخلية Ca2 + تركيز أثارت عند التنشيط CXCR4 قبل به مؤثر الذاتية، يجند تشيموكيني CXCL12 (المعروفة سابقا بخلية stromal المستمدة عامل 1α ( SDF1-α))، وتثبيط المحتملة لهذا CXCL12 الناجمة عن Ca2 + الرد بمركبات خاصة. وتستخدم في هذا التحليل، U87 جليوبلاستوما البشرية خلايا ستابلي التعبير عن مستقبلات CXCR4 البشرية. في الوقت نفسه، تفتقر هذه الخلايا الذاتية التعبير عن CXCR7، مستقبلات تشيموكيني ذات صلة التي تربط أيضا CXCL1215،،من1617. CXCR7 سابقا تبين أيضا أن تكون قادرة على تشكيل هيتيروديميرس مع CXCR4، وبالتالي تحوير مما يشير إلى خصائص هذا الأخير مستقبلات18. التقلبات في مستوى داخل الخلية Ca2 + توسط CXCR4 تخضع لتحميل CXCR4+ الخلايا مع إستر أسيتوكسيميثيل فلوو-2 (صباحا)، تقارب ارتفاع نفاذية خلية فلورسنت Ca2 +-ملزمة صبغ. فلوو-2 صباحا هو جزيء فلوري وحيدة الطول موجي يمكن متحمس في 490 نانومتر بينما يقاس به الأسفار الانبعاثات في 520 نانومتر. يزيد هذه الأسفار الانبعاثات عند Ca2 + ملزمة، مع مجموعة كبيرة ودينامية بين Ca2 +-منضمة وغير منضمة الدولة. الزيادة في فلوري إشارة عابرة، التي تحدث ضمن فاصل زمني من بضع دقائق، وسوف تسوس بعد ذلك. ارتفاع ذروة يرتبط زيادة الانبعاثات الفلورسنت مع مستوى تنشيط مستقبلات. المقايسة نفسها تتم باستخدام قارئ ميكروسكوبية الأسفار مزودة كاميرا تكثيف مكافحة التصحر (ICCD) التي تمتلك نظام متكامل بيبيتينج تسمح بتوحيد الخطوات بيبيتينج في التحليل (انظر الجدول للمواد) . وباﻹضافة إلى ذلك، قياس الإشارات الفلورسنت في جميع الآبار صفيحة المتزامن هو ميزة رئيسية أخرى للقارئ الأسفار التي يتم استخدامها. تحميل جزء من فحص المركبات قيد التحقيق (مثلاً، فريق من الجزيئات الصغيرة بتركيز ثابت أو في سلسلة تمييع) إضافة إلى قطع-2 صباحا خلال الأول CXCR4+ U87 الخلايا متبوعة ~ فترة الحضانة 10 دقيقة خلالها يتم قياس الأثر ناهضة من المركبات بشكل مستمر في الوقت الحقيقي. ثم، مؤثر الذاتية (أي، CXCL12) إضافة إلى الخلايا لاستحضار إلى CXCR4 بوساطة زيادة عابرة في مستوى Ca داخل الخلية2 +. أثناء هذا الجزء من المقايسة يمكن تقييم نشاط معادية محتملة من المركبات المختبرة. ويرد في الشكل 1نظرة تخطيطي لسير العمل العام للتحليل.
على الرغم من أن هذا Ca2 + تعبئة المقايسة استخدمت أساسا لتحديد فاعلية المثبطة للخصوم CXCR4 التنافسية (أي، والمركبات التي تمنع مؤثر الذاتية ربط وتحفز المستقبلات)، فإنه أيضا ويمكن تحديد مستقبلات يضع، والمركبات بالإضافة إلى ذلك، أن تمارس وظيفتها بالربط في مواقع اللوستيريك (أي، مواقع طبوغرافيا تختلف من موقع الربط أورثوستيريك تحتلها مؤثر الذاتية). وتشمل أمثلة على هذه الفئة الأخيرة من مركبات يضع allosteric و19،PAMs و NAMs20. في حين أن تمنع الخصوم مستقبلات محددة، فضلا عن NAMs CXCL12 الناجمة عن Ca2 + الاستجابة، PAMs من شأنه أن يعزز هذا الرد (انظر أيضا المناقشة القسم). على الرغم من الفحص الموضحة هنا على وجه التحديد أهداف CXCR4، فمن المتوقع أن يمكن تطبيق هذا الأسلوب إلى أخرى جبكرس مع جهد الحد الأدنى الأمثل، على الأقل إذا كانت إشارة عن طريق الإفراج عن كاليفورنيا داخل الخلية2 +.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluo-2 AM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142775</td>
			<td>fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMD3100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5602-5 mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maraviroc</td>
			<td>kind gift of AnorMed</td>
			<td></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CXCL12</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CCL5</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (T75)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plate, 96-well, clear bottom, with lid</td>
			<td>Costar/Fisher Scientific</td>
			<td>10530753</td>
			<td>assay plate (96-well), for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene (PP) plates</td>
			<td>Thermo Scientific (VWR)</td>
			<td>732-2661</td>
			<td>plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra high throughput cellular screening system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6128</td>
			<td>Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6203</td>
			<td>emission filter compatible with the fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra 96 Head</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0310-4536</td>
			<td>96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScreenWorks</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td>Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators

ز إلى جانب البروتين مستقبلات (جبكرس) ذات أهمية كبيرة لصناعة المستحضرات الصيدلانية كما أنهم يشاركون في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان وتشمل أهدافا تم التحقق من صحتها جيدا للتدخل العلاجي. اكتشاف مركبات الرصاص، بما في ذلك الجزيئات الاصطناعية الصغيرة، التي تمنع الدالة المستقبلات على وجه التحديد، هو خطوة أولى هامة في تطوير العقاقير ويعتمد على فحوصات حساسة ومحددة، وقوى يستند إلى الخلية. هنا، يمكننا وصف مقايسة خلوية حركية مع قراءات فلورية تهدف في المقام الأول تحديد الخصوم مستقبلات محددة التي تمنع داخل الخلية Ca2 + إطلاق سراح أثارت عند تنشيط مستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4) التي لها يجند الذاتية، يجند chemokine الامتحانات 12 (CXCL12). ومن مزايا رئيسية لهذا الأسلوب أنه يمكن أيضا فحص مركبات تتمتع بخواص ناهضة ذاتية (أي، مركبات التماس زيادة في داخل الخلية Ca2 + تركيز في الغياب CXCL12) أو المركبات تحوير وظيفة مستقبلات عن طريق التفاعل مع مواقع الربط اللوستيريك (أي، المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية (PAMs و NAMs، على التوالي)). وعلى الجانب السلبي، مركبات أوتوفلوريسسينت قد تتداخل مع قراءات للمقايسة، مما يعوق تفسير البيانات الموثوق بها. على الأرجح هذا التحليل يمكن أن تنفذ، مع الحد الأدنى من التكييف، مقايسة اكتشاف الأدوية للعديد من جبكرس الأخرى التي يؤدي التنشيط إلى إطلاق سراح من كاليفورنيا داخل الخلية2 +.

تأثير التحفيز CXCL12 على Ca2 + تعبئة داخل الخلايا في U87. CD4.CXCR4+ و U87. وتم تقييم الخلايا CD4 مع المقايسة Ca2 + تعبئة. بدلاً من 20 ميليلتر مركب الاختبار أن تضاف عادة أثناء الخطوة بيبيتينج الأولى من البروتوكول (الشكل 1)، تمت إضافة الإنزيم المخزن المؤقت إل...

Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

صمم المقايسة الخلوية وصف للتعرف على مستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4)-العوامل المتفاعلة التي تكبح أو حفز، أما بشكل تنافسي أو اللوستيريكالي، داخل الخلايا Ca2 + إطلاق سراح بدأها التنشيط CXCR4.

تعبئة مقايسة2 + من Ca المستندة إلى الأسفار حركية لتحديد يضع إلى جانب البروتين مستقبلات ز، والخصوم، والمغيرون Allosteric

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

The overall goal of this cell-based assay is to identify and characterize molecules capable of stimulating or inhibiting G protein-coupled receptor-mediated intracellular calcium mobilization. This method can be a valuable assay for G protein-coupled receptor drug discovery because it can be used to screen for molecules that modify receptor-mediated intracellular calcium bodies. The main advantage of this technique is that it allows molecules with agonistic or antagonistic properties to be identified within the same assay.This assay may help in the discovery of novel drug candidates that act on G protein-coupled receptors promising therapeutic targets that play a role in many human diseases. On the day of cell passaging, coat each well of a black walled polystyrene 96-well plate with clear bottoms with 100 microliters of 0.1%gelatin solution and incubate the plates for two hours at room temperature. While the gelatin is solidifying, use a trypsin EDTA solution to lift the cells of interest from the bottom of their culture flask, resuspending the cells in fresh growth medium in a 50 milliliter conical tube once they have detached.After counting, collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in fresh growth medium to a one times 10 to the fifth viable cells per milliliter concentration. When the plates are ready, discard any excess gelatin solution and dry the plates on a lab tissue. Then wash the wells with 200 microliters of PBS and replace the wash with 200 microliters of cells per well for an overnight incubation at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.The next morning, tap the plate to discard the growth medium from the wells and dry the plate upside on a paper towel. Then label the cells in each well with 100 microliters of loading dye solution per well and incubate the plate for 45 minutes in the dark at room temperature. While the cells are incubating, add 75 microliters of CXCL12 per well to the chemokine plate and 50 microliters of the compound of interest to each well of the compound plate.Next, turn on the cooler unit of the fluorescence plate reader followed by the plate reader itself. After allowing the system a few minutes to initiate, open the plate reader software. To set up the assay protocol, under the settings tab select read mode and the appropriate excitation and emission wavelengths for the loading dye.Select the mix with transfer fluid tab for automatic mixing of the compounds in the compound plate. In the transfer fluid tab, set 20 microliters of each well from the compound plate to be transferred into the measurement plate and position the pipette tips at 20 microliters below the liquid surface. Set the speed of aspiration to 50 microliters per second and the speed of dispensing to 25 microliters per second and click read with transfer fluid.During the first interval, select 60 reads with a read interval time of one second with 10 reads to be recorded before the compounds are dispensed into the measurement plate and 50 reads to be completed after. Set the second interval with a read interval time of 30 seconds and 18 reads. Select three tip washes for the protocol, setting each wash step to include the appropriate wash fluid, one wash cycle, a fast pump speed, and five strokes per wash.Use the pause pipettor function to include the pipettor pause of 300 seconds and use the mix with transfer fluid setting to allow automatic mixing of the CXCL12 solution within the chemokine plate. In the subsequent transfer fluid tab, set 25 microliters from each well of the chemokine plate to be transferred to the measurement plate and position the tips 20 microliters below the liquid surface. Set the aspiration speed to 50 microliters per second and the dispensing speed to 25 microliters per second.Use the read with transfer fluid button to set the first interval to include 145 reads with a read interval time of one second. Set the second interval to a read interval time of six seconds and 20 reads. Select three more wash tip cycles.Then click set stage temperature and set the device temperature to 37 degrees Celsius. At the end of the loading dye incubation, discard the buffer from the measurement plate and dry the plate on a lab tissue. Wash the cells with 150 microliters per well of assay buffer replacing the buffer with 80 microliters of assay buffer after two minutes.Place the measurement plate in the read position, the compound plate at the source two position, the chemokine plate at the source three position, and a box of black tips at the source one position. Close the device and click protocol signal test to determine the background relative light units and fluorescence variance over the plate. Select test signal in the popup window.If background values of 8, 000 to 10, 000 relative light units are obtained, select update and click save to save the main protocol. Then push run to start the assay. In this graph, a dose-dependent increase in fluorescence correlating with the dose-dependent increase in the release of calcium can be observed.Increasing levels of CXCL12-induced fluorescence allow the generation of a dose response curve based on the difference between the minimum and maximum response over baseline between the first measurement after addition addition of the chemokine and the final measurement in the protocol. No fluorescent calcium-related response was evoked by CXCL12 even at a high concentration when cells lacking the corresponding functional chemokine receptor CXCR4 were used demonstrating the receptor specificity of the CXCL12-evoked measurement. A key application for this cell-based assay is to identify small molecules that, following pre-incubation, dose dependently inhibit CXCL12-induced calcium mobilization in the cells as compared to control non-active compounds that do not inhibit the response.To determine the inhibitory potency of small molecules, a dose response curve can be generated for the inhibitory molecules using nonlinear regression. This assay can be used to study other G protein-coupled receptors with no or only minimal further optimization as well as in this experiment in which a dose-dependent increase in fluorescence was observed when another chemokine receptor, CCR5, was stimulated with its natural chemokine agonist CCL5. Once mastered, this technique can be used to study many other G-protein coupled receptors that signal via the mobilization of intracellular calcium ions upon receptor activation.After watching this video, you should have a good understanding of how this cellular assay can be used to identify agonists and antagonists of the CXCL4 chemokine receptor.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

استراتيجية لتحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th استئصال الكلية في تركيبة مع حمية عالية الملح والنيتريك أوكسيد تثبيط سينسيز للحث على مرض الكلى المزمن في الفئران لويس

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

الاستفادة من الفحص لينة آجار مستعمرة تشكيل لالتعرف مثبطات Tumorigenicity في خلايا سرطان الثدي

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

بالون إصابة الفئران السباتي نموذج لاختبار التداوي إعادة عرض لمكافحة الأوعية الدموية

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

تجربة سريرية لتقييم سلامة وفعالية وتسليم أكياس ثلاث غرف من زيت الزيتون للتغذية بالحقن

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

مقايسة علي أساس الفلورية لتوصيف وتحديد كميات الدهون التجميعية في تشكيل الأمعاء البشرية

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

بروتوكول فحص حفرة بسيط لتصور وقياس امتصاص الخلايا العظمية في المختبر

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

تحليل ضعف انقباض القلب و Ca2+ عابر في الخلايا العضلية القوارض

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...