Name: a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators
Uploaded: 2018-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

Die Autoren möchten Eric Fonteyn und Geert Schoofs für ausgezeichnete technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde unterstützt von der KU Leuven (keine zu gewähren. PF/10/018), den Fonds Voor Wetenschappelijk Onderzoek-(FWO, Nein zu gewähren. G.485.08), und die Fondation Dormeur Vaduz.

Hinweis: Alle in den Abschnitten 1 und 2 beschriebenen Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow Kabinett durchgeführt.
1. Wartung von U87. CD4.hCXCR4 Zellen
<ol><li>Wachsen Sie die Zellen in T75 Kulturflaschen bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Hinweis: Die in-vitro- Zellinie in diesem Protokoll verwendeten ist ein U87 Glioblastom-Zelllinie stabil Cluster der Differenzierung 4 (CD4) und Menschen zum Ausdruck bringen CXCR4 ...

<ol>
	<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+a+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: a short history.</a> Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+non-peptide+small+molecular+CXCR4+antagonists+as+anti-HIV+agents:+Recent+advances+and+future+opportunities.">Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities.</a> Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Tsou, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plerixafor:+a+review+of+its+use+in+stem-cell+mobilization+in+patients+with+lymphoma+or+multiple+myeloma.">Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma.</a> Drugs. 71, 1623-1647 (2011).</li><li>DiPersio, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+prospective+randomized+double-blind+placebo-controlled+trial+of+plerixafor+plus+granulocyte+colony-stimulating+factor+compared+with+placebo+plus+granulocyte+colony-stimulating+factor+for+autologous+stem-cell+mobilization+and+transplantation+for+patients+with+non-Hodgkin's+lymphoma.">Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).</li><li>Balabanian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+heterodimerizes+with+CXCR4+and+regulates+CXCL12-mediated+G+protein+signaling.">CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling.</a> Blood. 113, 6085-6093 (2009).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+identification+of+allosteric+modulators+of+G-protein-coupled+receptors.">Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).</li><li>Hendrix, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety,+pharmacokinetics,+and+antiviral+activity+of+AMD3100,+a+selective+CXCR4+receptor+inhibitor,+in+HIV-1+infection.">Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).</li><li>Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicyclams,+a+class+of+potent+anti-HIV+agents,+are+targeted+at+the+HIV+coreceptor+fusin/CXCR-4.">Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4.</a> Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No-wash+dyes+for+calcium+flux+measurement.">No-wash dyes for calcium flux measurement.</a> Biotechniques. 34, 164-166 (2003).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+over-expression+and+survival+in+cancer:+a+system+review+and+meta-analysis.">CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis.</a> Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activity+and+inverse+agonists+of+G+protein-coupled+receptors:+a+current+perspective.">Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective.</a> Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).</li><li>Kenakin, T., Miller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+receptors+as+shapeshifting+proteins:+the+impact+of+allosteric+modulation+and+functional+selectivity+on+new+drug+discovery.">Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).</li><li>Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+GPCRs:+a+novel+approach+for+the+treatment+of+CNS+disorders.">Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).</li><li>Burford, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+positive+allosteric+modulators+and+silent+allosteric+modulators+of+the+mu-opioid+receptor.">Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).</li><li>Bartfai, T., Wang, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+allosteric+modulators+to+peptide+GPCRs:+a+promising+class+of+drugs.">Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs.</a> Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).</li><li>Hatse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activity+of+G-protein-coupled+receptors:+cause+of+disease+and+common+property+of+wild-type+receptors.">Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).</li><li>Zhang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+that+confers+constitutive+activity+to+CXCR4+reveals+that+T140+is+an+inverse+agonist+and+that+AMD3100+and+ALX40-4C+are+weak+partial+agonists.">A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists.</a> J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).</li><li>Tamamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-molecular-weight+inhibitor+against+the+chemokine+receptor+CXCR4:+a+strong+anti-HIV+peptide+T140.">A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140.</a> Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).</li><li>Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).</li></ol>

Die Ca2 +-Mobilisierung Assay beschriebenen hat zuvor gezeigt, dass ein wertvolles Instrument zu identifizieren und zu charakterisieren, targeting CXCR417-Rezeptor-Antagonisten. Es ist, jedoch erwartet, dass diese Methode im Allgemeinen kann für eine große Gruppe von anderen GPCRs, die eine cytosolische Ca2 + Version auf ihre Aktivierung auslösen angewendet werden wie für den entsprechenden Chemokin-Rezeptor CCR5 dargestellt. Im Falle von CCR5 genau die gleichen Versuchsb...

GPCRs sind eine wichtige Superfamilie Zelle Oberflächenproteine, die Transduktion Signalkaskaden bei extrazellulären Liganden Bindung zu aktivieren. Sie können durch eine Vielzahl von Reizen wie Peptide, Proteinhormone, biogene Amine und Lipide, aktiviert werden die Ergebnisse in der Einleitung der unterschiedlichen intrazellulären Signalwege und schließlich biologischen Reaktionen1,2 . Darüber hinaus GPCRs engagieren sich in vielen, wenn nicht alle Entwicklungs- und physiologische Prozesse und viele menschliche Erkrankungen werden mit dysfunktionalen GPCR-Signalisierung oder Rezeptor-Überexpression in Verbindung gebracht. GPCRs gehören daher die meisten validierten pharmakologische Ziele in Medizin1,3.
In der Regel beginnt ein GPCR Drug Discovery Workflow zellulären Screening-Tests ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen wie kleine Moleküle, monoklonale Antikörper und Peptide, die die Aktivität von bestimmten GPCR modulieren können. In GPCR Arzneimittelforschung, dass viele verschiedene Arten von Tests vorhanden sind, um solche Verbindungen zu suchen sind die meisten davon mit Mitte - zum Hochdurchsatz-Screening Kampagnen kompatibel. Die am häufigsten verwendeten Assays gehören Rezeptor-Bindung-Experimente, Fluoreszenz und Lumineszenz basierte Assays erkennen die Schwankungen der so genannte sekundäre Botenstoffe (z.B. Ca2 +, zyklische Adenosin Monophosphate (AMP)), phänotypische Screening-Assays und β-arrestin Rekrutierung assays4. Die Wahl für eine bestimmte Art von Assay kann von mehreren Faktoren abhängen, sondern richtet sich auch nach Vorwissen über die Signalisierung Eigenschaften einer gegebenen GPCR. Agonisten binden an ein GPCR induziert eine Konformationsänderung katalysieren den Austausch von Guanidin diphosphat (BIP) für Guanidin Triphosphat (GTP) auf die α-Untereinheit des Heterotrimeric G-Proteine. Anschließend die Gα-GTP-Untereinheit distanziert sich von den G-βγ -Untereinheit und beide Untereinheiten werden weitere Signalwege zu initiieren. Hydrolyse der GTP-Molekül und anschließende erneute Vereinigung von Gα- BIP und Gβγ Untereinheiten werden das G-Protein in seine inaktiven Konformation5,6wiederherzustellen. Basierend auf Sequenzähnlichkeit der G-α -Untereinheit werden verschiedene Arten von G-Proteinen definiert (G-s, Gich, GQ, G12/13)7. Signalisierung über die G-α Untereinheit gibt steigen mehrere typische Reaktionen wie z. B. die Erhöhung (über G-s) oder verringern (über Gich) zyklisches AMP Produktions-und intrazellulären Ca2 + Mobilisierung (über G-Q)5 ,7. Gβγ Untereinheiten sind auch in der Lage, intrazelluläre Effektor Wege zu induzieren. Zum Beispiel bei einer Aktivierung der Gich-gekoppelten GPCRs, Gβγ können direkt stimulieren Phospholipase C (PLC-β), Inositol-Triphosphat (IP3) zu produzieren, die die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären Speichern7 auslöst . Nach der Aktivierung der Rezeptor sind GPCRs phosphoryliert von GPCR Kinasen (GRKs) die Interaktion mit β-Arrestins fördert. Dieser Prozess endet G Protein signaling und führt zu Rezeptor Desensibilisierung und schließlich Verinnerlichung. Β-Arrestins sind auch in der Lage, Multi-molekulare komplexe bilden, die andere Signalwege unabhängig von G Protein signaling8auslösen können.
Innerhalb der Unterfamilie der Chemokin-Rezeptoren, die Gich-gekoppelten CXCR4 ist ein GPCR, die viel Interesse als ein viel versprechendes Ziel für die Wirkstoffforschung ausgelöst hat. Angesichts seiner etablierten Rolle als eine große Ko-Rezeptor für Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) 1 wurden virale Eintrag und Infektion, Verbindungen gezielt CXCR4 zunächst als Anti-HIV-Medikament Kandidaten9entwickelt. Vor kurzem hat eine wachsende Zahl von Beweisen auf eine wichtige Rolle für CXCR4 in Tumorgenese und Krebs Metastasen, so dass es eine gut validierte therapeutische Ziel in der Onkologie sowie10hingewiesen. CXCR4 ist hoch in mehr als zwanzig Arten von Krebserkrankungen und Steuerelemente Tumor Zelle überleben, Verbreitung, sowie Migration und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese10ausgedrückt. CXCR4-Antagonisten von verschiedenen chemischen Klassen wurden zuvor beschriebenen11,12, sondern nur das kleine Molekül AMD3100 derzeit für den Einsatz in der Klinik als Stammzell-Mobilisierung Agent verwendet während der Behandlung des Lymphoms zugelassen und Myelom-Patienten13,14. Klinische Studien sind im Gange, die Sicherheit und Wirksamkeit von mehreren anderen CXCR4-Antagonisten in verschiedenen Krankheiten des Menschen, aber mit einem starken Fokus auf Onkologie12bewertet. Angesichts der vielen Anwendungsmöglichkeiten für CXCR4-Antagonisten, ist die Suche nach neuartigen Verbindungen mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften, verbesserte Bioverfügbarkeit oder möglicherweise weniger Nebenwirkungen gerechtfertigt.
Hierin eine kinetische Fluoreszenz basierende zelluläre Assays in erster Linie verwendet, um Bildschirm für Verbindungen in der Lage, Hemmung CXCR4 wird beschrieben. Die fluoreszente Messung dieser Methode basiert auf der vorübergehende Anstieg der intrazellulären Ca2 + Konzentration auf CXCR4 Aktivierung durch die endogene Agonist, der Chemokin-Liganden CXCL12 (früher bekannt als Stromazellen Zelle Faktor 1α abgeleitet (hervorgerufen SDF1-α)), und die möglichen Hemmung dieser CXCL12-induzierte Ca2 + Reaktion durch bestimmte Verbindungen. In diesem Test werden U87 menschlichen Glioblastom-Zellen stabil mit dem Ausdruck des menschlichen Rezeptors CXCR4 verwendet. Zur gleichen Zeit fehlt diese Zellen endogene Expression von CXCR7, einem Verwandten Chemokin-Rezeptor, der auch CXCL1215,16,17 bindet. CXCR7 zuvor auch nachweislich bilden Heterodimere mit CXCR4, werden dadurch modulieren die Signalisierung Eigenschaften dieser letzteren Rezeptor-18. Die Schwankungen der intrazellulären Ca2 + von CXCR4 vermittelt werden durch das Laden der CXCR4 überwacht+ Zellen mit Fluo-2 Acetoxymethyl (AM) Ester, eine Zelle durchlässig hohe Affinität fluoreszierende Ca2 +-bindende Farbstoff. Fluo-2 Uhr ist eine einzelne Wellenlänge fluoreszierende Molekül, das auf 490 angeregt werden kann nm während der Emission Fluoreszenz bei 520 gemessen wird nm. Diese Fluoreszenz Emission erhöht sich auf Ca2 + Bindung mit einem großen Dynamikbereich zwischen Ca2 +-gebunden und ungebunden Zustand. Die Zunahme der Fluoreszenzsignal ist vergänglich, auftreten innerhalb einer Zeitspanne von ein paar Minuten, und wird danach verfallen. Die Peakhöhe der die Fluoreszenz Emission weiterer korreliert mit dem Niveau der Rezeptor-Aktivierung. Der Test selbst erfolgt mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader verfügt über eine intensivierte CCD (ICCD) Kamera, die ein integriertes Pipettierens System besitzt, die Standardisierung der Pipettier Schritte in der Probe ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien) . Darüber hinaus ist die gleichzeitige Messung von das Fluoreszenzsignal in alle Vertiefungen der einer Mikrotestplatte ein weiterer wesentlicher Vorteil der Fluoreszenz-Leser, die verwendet wird. Während der erste Teil des Tests die Verbindungen untersucht (z.B. eine Gruppe von kleinen Molekülen in einer festen Konzentration oder in einer Verdünnungsreihe), um die Fluo-2 Uhr hinzugefügt werden geladen CXCR4+ U87 Zellen gefolgt von einer ~ 10 min Inkubationszeit während dessen wird die potenzielle agonistische Wirkung der Verbindungen kontinuierlich in Echtzeit gemessen. Dann die endogenen Agonisten (d. h.CXCL12) wird hinzugefügt, um die Zellen zu einen CXCR4-vermittelten vorübergehenden Anstieg der Ebene der intrazellulären Ca2 +evozieren. In diesem Teil des Tests kann die potenziellen antagonistische Aktivität der getesteten Verbindungen ausgewertet werden. Ein schematischer Überblick über die Assay allgemeinen Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.
Obwohl in erster Linie diese Ca2 + Mobilisierung Assay verwendet worden ist, zu identifizieren und zu bestimmen, die inhibitorische Potenz von wettbewerbsfähigen CXCR4-Antagonisten (d.h., Verbindungen, die verhindern, dass die endogene Agonisten stimulieren den Rezeptor zu binden), es auch -Rezeptor-Agonisten identifizieren können und darüber hinaus Verbindungen, die ihre Funktion durch die Bindung an allosterische Standorten (z.B. Websites, die topographisch unterscheiden sich von den Orthosteric-Bindungsstelle von endogenen Agonisten besetzt) ausüben. Beispiele für die zweite Kategorie von Verbindungen allosterische Agonisten und PAMs und NAMs19,20. Während spezifischen Rezeptor-Antagonisten sowie NAMs CXCL12-induzierte Ca2 + Reaktion hemmen würde, PAMs würde diese Reaktion zu verbessern (siehe auch Diskussion Abschnitt). Obwohl der Test hier speziell CXCR4 Ziele beschrieben, es wird davon ausgegangen, dass diese Methode auf andere GPCRs mit minimalen Optimierung Aufwand mindestens angewendet werden kann wenn sie über die Freigabe des intrazellulären Ca2 +signalisieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluo-2 AM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142775</td>
			<td>fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMD3100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5602-5 mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maraviroc</td>
			<td>kind gift of AnorMed</td>
			<td></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CXCL12</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CCL5</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (T75)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plate, 96-well, clear bottom, with lid</td>
			<td>Costar/Fisher Scientific</td>
			<td>10530753</td>
			<td>assay plate (96-well), for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene (PP) plates</td>
			<td>Thermo Scientific (VWR)</td>
			<td>732-2661</td>
			<td>plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra high throughput cellular screening system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6128</td>
			<td>Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6203</td>
			<td>emission filter compatible with the fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra 96 Head</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0310-4536</td>
			<td>96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScreenWorks</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td>Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators

G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) sind für die pharmazeutische Industrie von großer Bedeutung, da sie bei vielen menschlichen Krankheiten beteiligt sind und gut validierte für eine therapeutische Intervention Zielvorgaben. Entdeckung von Bleiverbindungen, einschließlich kleine synthetische Moleküle, die speziell die Rezeptor-Funktion hemmen, ist ein erster wichtiger Schritt in der Medikamentenentwicklung und stützt sich auf sensible, spezifische und robuste zellbasierte Assays. Hier beschreiben wir einen kinetische zellularen Assay mit einer fluoreszierenden Anzeige in erster Linie entwickelt, um spezifischen Rezeptor-Antagonisten zu identifizieren, die die intrazelluläre Ca2 + Freigabe, hervorgerufen durch die Aktivierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen, indem seine endogenen Liganden, der CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12). Ein entscheidender Vorteil dieser Methode ist, dass es ermöglicht auch Screening von Verbindungen mit agonistischen Eigenschaften (d.h., Verbindungen, die einen Anstieg der intrazellulären Ca2 + Konzentration in der Abwesenheit von CXCL12 zu entlocken) oder Verbindungen ausgestattet Modulation der Rezeptor-Funktion durch Interaktion mit allosterische Bindungsstellen (d.h., positive und negative allosterische Modulatoren (PAMs und NAMs, beziehungsweise)). Auf der anderen Seite können die Probe auslesen, dadurch behindert zuverlässige Dateninterpretation Autofluorescent Verbindungen beeinträchtigen. Am ehesten kann dieser Assay mit minimalen Anpassungen als ein generisches Medikament Entdeckung Assay für viele andere GPCRs umgesetzt werden, von denen die Aktivierung zu einer Freisetzung von intrazellulären Ca2 führt +.

Die Wirkung von CXCL12-Stimulation auf die intrazelluläre Ca2 + Mobilisierung in U87. CD4.CXCR4+ und U87. CD4-Zellen wurde mit Ca2 + Mobilisierung Assay bewertet. Statt 20 µL Testverbindung, die normalerweise während der ersten Pipettieren Schritt des Protokolls (Abbildung 1) hinzugefügt werden würden, Testpuffer wurde hinzugefügt, um die Fluo-2 AM U87 geladen. CD4.CXCR4+ Zellen in der Messung-Platte. Während...

Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Beschriebenen zelluläre Assay dient zur Identifizierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4)-interaktiver Agenten, die hemmen oder fördern, kompetitiv oder allosterically, die intrazelluläre Ca2 + Release von CXCR4 Aktivierung initiiert.

Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

The overall goal of this cell-based assay is to identify and characterize molecules capable of stimulating or inhibiting G protein-coupled receptor-mediated intracellular calcium mobilization. This method can be a valuable assay for G protein-coupled receptor drug discovery because it can be used to screen for molecules that modify receptor-mediated intracellular calcium bodies. The main advantage of this technique is that it allows molecules with agonistic or antagonistic properties to be identified within the same assay.This assay may help in the discovery of novel drug candidates that act on G protein-coupled receptors promising therapeutic targets that play a role in many human diseases. On the day of cell passaging, coat each well of a black walled polystyrene 96-well plate with clear bottoms with 100 microliters of 0.1%gelatin solution and incubate the plates for two hours at room temperature. While the gelatin is solidifying, use a trypsin EDTA solution to lift the cells of interest from the bottom of their culture flask, resuspending the cells in fresh growth medium in a 50 milliliter conical tube once they have detached.After counting, collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in fresh growth medium to a one times 10 to the fifth viable cells per milliliter concentration. When the plates are ready, discard any excess gelatin solution and dry the plates on a lab tissue. Then wash the wells with 200 microliters of PBS and replace the wash with 200 microliters of cells per well for an overnight incubation at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.The next morning, tap the plate to discard the growth medium from the wells and dry the plate upside on a paper towel. Then label the cells in each well with 100 microliters of loading dye solution per well and incubate the plate for 45 minutes in the dark at room temperature. While the cells are incubating, add 75 microliters of CXCL12 per well to the chemokine plate and 50 microliters of the compound of interest to each well of the compound plate.Next, turn on the cooler unit of the fluorescence plate reader followed by the plate reader itself. After allowing the system a few minutes to initiate, open the plate reader software. To set up the assay protocol, under the settings tab select read mode and the appropriate excitation and emission wavelengths for the loading dye.Select the mix with transfer fluid tab for automatic mixing of the compounds in the compound plate. In the transfer fluid tab, set 20 microliters of each well from the compound plate to be transferred into the measurement plate and position the pipette tips at 20 microliters below the liquid surface. Set the speed of aspiration to 50 microliters per second and the speed of dispensing to 25 microliters per second and click read with transfer fluid.During the first interval, select 60 reads with a read interval time of one second with 10 reads to be recorded before the compounds are dispensed into the measurement plate and 50 reads to be completed after. Set the second interval with a read interval time of 30 seconds and 18 reads. Select three tip washes for the protocol, setting each wash step to include the appropriate wash fluid, one wash cycle, a fast pump speed, and five strokes per wash.Use the pause pipettor function to include the pipettor pause of 300 seconds and use the mix with transfer fluid setting to allow automatic mixing of the CXCL12 solution within the chemokine plate. In the subsequent transfer fluid tab, set 25 microliters from each well of the chemokine plate to be transferred to the measurement plate and position the tips 20 microliters below the liquid surface. Set the aspiration speed to 50 microliters per second and the dispensing speed to 25 microliters per second.Use the read with transfer fluid button to set the first interval to include 145 reads with a read interval time of one second. Set the second interval to a read interval time of six seconds and 20 reads. Select three more wash tip cycles.Then click set stage temperature and set the device temperature to 37 degrees Celsius. At the end of the loading dye incubation, discard the buffer from the measurement plate and dry the plate on a lab tissue. Wash the cells with 150 microliters per well of assay buffer replacing the buffer with 80 microliters of assay buffer after two minutes.Place the measurement plate in the read position, the compound plate at the source two position, the chemokine plate at the source three position, and a box of black tips at the source one position. Close the device and click protocol signal test to determine the background relative light units and fluorescence variance over the plate. Select test signal in the popup window.If background values of 8, 000 to 10, 000 relative light units are obtained, select update and click save to save the main protocol. Then push run to start the assay. In this graph, a dose-dependent increase in fluorescence correlating with the dose-dependent increase in the release of calcium can be observed.Increasing levels of CXCL12-induced fluorescence allow the generation of a dose response curve based on the difference between the minimum and maximum response over baseline between the first measurement after addition addition of the chemokine and the final measurement in the protocol. No fluorescent calcium-related response was evoked by CXCL12 even at a high concentration when cells lacking the corresponding functional chemokine receptor CXCR4 were used demonstrating the receptor specificity of the CXCL12-evoked measurement. A key application for this cell-based assay is to identify small molecules that, following pre-incubation, dose dependently inhibit CXCL12-induced calcium mobilization in the cells as compared to control non-active compounds that do not inhibit the response.To determine the inhibitory potency of small molecules, a dose response curve can be generated for the inhibitory molecules using nonlinear regression. This assay can be used to study other G protein-coupled receptors with no or only minimal further optimization as well as in this experiment in which a dose-dependent increase in fluorescence was observed when another chemokine receptor, CCR5, was stimulated with its natural chemokine agonist CCL5. Once mastered, this technique can be used to study many other G-protein coupled receptors that signal via the mobilization of intracellular calcium ions upon receptor activation.After watching this video, you should have a good understanding of how this cellular assay can be used to identify agonists and antagonists of the CXCL4 chemokine receptor.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Forschung

Medizin

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrektomie in Kombination mit hohen Salz-Diät-und Stickstoffmonoxid-Synthase-Hemmung zu Chronic Kidney Disease in der Lewis-Ratte induzieren

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

Eine Ratte Karotis-Ballon-Verletzung Modell Anti-vaskuläre Remodeling Therapeutics zu Test

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolierung und Kultur von primären Endothelzellen von Canine Arterien und der

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Eine klinische Studie zur Bewertung der Sicherheit, Wirksamkeit und Lieferung von Dreikammerbeuteln auf Olivenölbasis für die parenterale Ernährung

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca2+ Transienten in Nagetiermyozyten

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...