Name: a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators
Uploaded: 2018-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

著者は、優れたテクニカル サポートにエリック ・ フォンテーン、Geert Schoofs を感謝したいです。この作品は、ルーヴェンに支えられている (no を付与します。PF/10/018)、フォンや Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、いいえを付与します。G.485.08) と財団ドルムール ファドゥーツ。

注: 1 と 2 のセクションで説明したすべてのステップ キャビネット層流無菌条件の下で実行されます。
1. U87 のメンテナンス。CD4.hCXCR4 セル
<ol><li>加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でコート t75 フラスコ培養フラスコで細胞を成長します。 注: このプロトコルで使われる培養細胞のラインは安定に発現する分化 4 のクラスター (CD4) と人間 U87 膠芽...

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Ca2 +の動員アッセイ記載以前の識別し、CXCR417のターゲット受容体拮抗薬の分類に貴重なツールであること示されています。ただし、関連ケモカイン受容体 CCR5 の示すようにこのメソッドことができますより一般的にその起動時に、ゾル性細胞質 Ca2 +放出を引き起こす他の Gpcr の大規模なグループに適用することも予想されます。(例えば、セル番号め?...

Gpcr は、細胞外リガンド結合に伴うシグナル伝達カスケードを活性化する細胞表面タンパク質の重要なスーパーファミリーです。彼らは多様な細胞内シグナル伝達経路、最終的に生体反応1,2 の開始で起因するペプチド、タンパク質ホルモン類、アミン、脂質などの刺激の大きい変化によってアクティブにできます。.また、Gpcr が場合すべてではない発達的および生理学的プロセスの多くでは、関与している、多くの人間の病気は機能不全の GPCR シグナリングまたは受容体発現に関連付けられています。Gpcr したがって医学1,3で最も検証された薬理学的ターゲット中です。
通常、GPCR 創薬探索ワークフローは細胞スクリーニング アッセイなど小さな分子、モノクローナル抗体と特定の GPCR の活性を調節することができるペプチド化合物の識別を有効にすると起動します。ほとんどは、GPCR 創薬アッセイの多くの異なる種類が存在そのような化合物を検索する、半ば-に高スループットス クリーニング キャンペーンと互換性があります。最もよく使われるアッセイは、受容体結合実験蛍光または発光ベースのいわゆる二次メッセンジャーの (例えばCa2 +、環状アデノシン一リン酸 (AMP))、表現型レベルの変動を検出の試金スクリーニング アッセイと β アレスチン募集4をの試金します。特定タイプの試金のための選択は複数の要因によって決まるかもしれないが、または、特定の GPCR シグナリングのプロパティに関する事前の知識によって決まります。アゴニスト GPCR に結合は、ヘテロ三量体 G 蛋白の α サブユニットにグアニジン二リン酸 (GDP) グアニジン三リン酸 (GTP) のための交換の触媒構造変化を誘導します。その後 Gα-GTP サブユニットは Gβγサブユニットから分離し、両方のサブユニット、さらにシグナル伝達経路を開始します。加水分解 GTP 分子と Gα会のそれに続く再 GDP と Gβγサブユニットが復元の G 蛋白質の使用頻度の低い構造5,6に。基づく Gαサブユニットの配列類似性で G タンパク質の種類が定義され (GsG は私Gq、G12/13)7。Gαを介してシグナル伝達サブユニットを与える (Gs) を介して増加などいくつかの典型的な応答に上昇またはサイクリック AMP 生産と細胞内 Ca2 +動態 (Gq) 経由の (G私) を介して減少5 ,7。Gβγサブユニットは、細胞内エフェクター経路を誘発することがあります。G は私の活性化の時に、例えば、-結合 Gpcr、Gβγがホスホリパーゼ C (PLC β) イノシトール三リン酸 (IP3) を生成する7 細胞内ストアからの Ca2 +放出をトリガーするを直接刺激できます。.受容体の活性化、次の Gpcr は GPCR キナーゼ (GRKs) β-arrestins との相互作用を促進するリン酸化します。このプロセスは、G タンパク質シグナル伝達を終了し、受容体の脱感作と最終的に内面化に 。Β arrestins は G タンパク質シグナル8に依存しないその他のシグナル伝達経路を引き起こすことができる多分子複合体を形成することがあります。
ケモカイン受容体、G私の亜科内-結合 CXCR4 は GPCR 創薬のための有望なターゲットとして多くの関心を引き起こした。ひと免疫不全ウイルス (HIV-1) の 1 の主要な共受容体としての確立された役割を与えられたウイルスや感染症, CXCR4 をターゲット化合物最初抗 HIV 薬候補9として開発されました。最近では、証拠の成長するボディを指摘している重要な役割 CXCR4 の腫瘍もよく検証された治療上のターゲットを作る腫瘍や癌の転移で10。CXCR4 は、高いひと癌とコントロール腫瘍細胞の生存、増殖、移動および腫瘍関連血管新生10の 20 以上の種類で表されます。CXCR4 アンタゴニストの異なった化学クラス説明11,12, AMD3100 は、リンパ腫の治療中に使用される幹細胞動員エージェントとしての診療所で使用するため承認されています小さな分子のみがされていた骨髄腫患者13,14。臨床試験は、継続的な安全性と他のいくつかの CXCR4 アンタゴニスト腫瘍12に重点が異なる疾患での効果を評価します。CXCR4 アンタゴニストの多くの潜在的なアプリケーションを考えると、改善された薬物動態的特性、バイオアベイラビリティを改善した、または可能性があります少ない副作用と新規物質の探索が必要です。
ここで、キネティック蛍光ベースのアッセイは、主に使用 CXCR4 を妨げることができる化合物をスクリーニングを説明。このメソッドの蛍光測定に基づいてその内因性アゴニスト、ケモカイン リガンド (以前として知られている間質細胞由来因子 1 α (cxcl 12 CXCR4 アクティベーション時に誘発される細胞内 Ca2 +濃度の一時的な増加SDF1-α))、および潜在的な特定の混合物によってこの cxcl 12 による Ca2 +応答抑制。このアッセイ人間 CXCR4 受容体を安定に発現する U87 ひと膠芽腫細胞を使用します。同時にこれらの細胞は、CXCR7、また連結 cxcl 1215,16,17関連ケモカイン受容体の内因性表現を欠いています。CXCR7 以前も示されている CXCR4 とヘテロを形成できるとそれによってこの後者の受容器18の信号の特性を調節すること。細胞内 Ca2 + CXCR4 による媒介のレベルの変動は、CXCR4 を読み込みによって監視される蛍光 2 アセトキシメチルセファロスポリン (午前) エステル、細胞膜透過性の高い親和性蛍光 Ca2 +による細胞の+ -色素を結合します。蛍光色 2 AM は 490 で励起されることができます単一波長の蛍光分子 520 でその発光蛍光を測定しながら nm nm。この発光蛍光 Ca2 +結合、Ca2 +の間の広いダイナミック レンジを増加-バインドし、非連結状態。蛍光信号の増加は一時的なもので、数分の時間間隔内で発生する、その後崩壊します。受容体活性化のレベルと蛍光放出さらに相関のピーク高さ。アッセイのピペッティングの手順の標準化を可能にする統合ピペッティング システムを所有している激化 CCD (ICCD) カメラを装備して蛍光マイクロ プレート リーダーを用いて自身を分析 (材料の表を参照).さらに、マイクロ プレートのすべての井戸の蛍光信号の同時測定は、使用される蛍光リーダーのもう一つ重要な利点です。最初の調査 (例えば、小分子固定濃度、希釈系列のパネル) 化合物は蛍光 2 AM に追加される試金の一部ロード CXCR4+ U87 細胞が続いて、~ 10 分潜伏期間中には、化合物の潜在的な敵対効果継続的にリアルタイムで測定されます。その後、内因性アゴニスト (すなわち、cxcl 12) CXCR4 を介した細胞内 Ca2 +のレベルの一時的な増加を換起するセルに追加されます。アッセイのこの部分の間にテストされた化合物の潜在的な敵対的活動を評価できます。図 1として概略試験の一般的なワークフローを説明します。
この Ca2 +動員アッセイは、識別し、競争力のある CXCR4 アンタゴニスト (すなわち、バインドし、受容体を刺激する内因性アゴニストを防ぐ化合物) の抑制の効力を決定に主に使用されていますがそれも受容体アゴニストを識別することができ、さらに、化合物のアロステリック サイト (すなわち、内因性アゴニストによって占められる orthosteric 結合部位とは異なる地形的サイト) で結合することによりその機能を発揮します。化合物の後者のカテゴリーには、アロステリック アゴニストおよび PAMs と NAMs19,20があります。PAMs がこの応答を強化する一方、特定の受容体拮抗薬として NAMs cxcl 12 による Ca2 +応答を阻害するが、(また見なさい議論セクション)。このメソッドは、少なくとも最小限の最適化の努力で他の Gpcr に適用できるが予想されるが、アッセイは、特にターゲット CXCR4 を記載、彼らは細胞内 Ca2 +のリリースを介して信号する場合。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluo-2 AM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142775</td>
			<td>fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMD3100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5602-5 mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maraviroc</td>
			<td>kind gift of AnorMed</td>
			<td></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CXCL12</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CCL5</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (T75)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plate, 96-well, clear bottom, with lid</td>
			<td>Costar/Fisher Scientific</td>
			<td>10530753</td>
			<td>assay plate (96-well), for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene (PP) plates</td>
			<td>Thermo Scientific (VWR)</td>
			<td>732-2661</td>
			<td>plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra high throughput cellular screening system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6128</td>
			<td>Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6203</td>
			<td>emission filter compatible with the fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra 96 Head</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0310-4536</td>
			<td>96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScreenWorks</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td>Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators

彼らは多くの疾患に関与している、よく検証された治療的介入の対象としては G タンパク質共役受容体 (Gpcr)、製薬業界にとって非常に重要です。小さく総合的な分子、受容体の機能を阻害する具体的を含む、リード化合物の発見は新薬開発の重要な最初のステップは、敏感な具体的で、堅牢な細胞ベースのアッセイに頼る。ここで、によって運動アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) の活性化に誘発される細胞内の Ca2 +放出を抑制する受容体の拮抗薬を識別するために主に設計されている蛍光読み出しと説明、内因性リガンド、CXC ケモカイン配位子 12 (cxcl 12)。この方法の主な利点は、また組み込みの敵対プロパティ (すなわち、化合物の細胞内 Ca2 +濃度がない場合 cxcl 12 の増加を誘発) 又は化合物に恵まれている化合物のスクリーニングできます。アロステリック結合部位との相互作用を介して受容体の機能を調節すること (すなわち、正と負のアロステリック変調 (Pam と NAMs、それぞれ))。ダウン側に蛍光化合物は、アッセイの読み出し、それにより信頼性の高いデータの解釈を妨げると干渉する可能性があります。最も可能性の高いこのアッセイとして実装できます、最小限の適応するの活性化は、細胞内 Ca2 +のリリースにつながる他の多くの Gpcr のジェネリック医薬品検出アッセイ。

U87 で細胞内 Ca2 +動員に cxcl 12 刺激の影響。CD4.CXCR4+と U87。CD4 細胞は、Ca2 +動員アッセイで評価されました。プロトコル (図 1) の最初の分注ステップ中に通常追加されるテスト混合物の 20 μ L、代わりにアッセイバッファーに追加された蛍光 2 AM U87 を読み込まれます。CD4.CXCR4+細胞測定プレート。2 番目の調剤手順?...

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A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

説明アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) を識別するために設計されています-エージェントを阻害するまたは競争または、アロステリックに CXCR4 活性化による細胞内 Ca2 +放出を刺激します。

キネティック蛍光ベースの Ca2 +動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

The overall goal of this cell-based assay is to identify and characterize molecules capable of stimulating or inhibiting G protein-coupled receptor-mediated intracellular calcium mobilization. This method can be a valuable assay for G protein-coupled receptor drug discovery because it can be used to screen for molecules that modify receptor-mediated intracellular calcium bodies. The main advantage of this technique is that it allows molecules with agonistic or antagonistic properties to be identified within the same assay.This assay may help in the discovery of novel drug candidates that act on G protein-coupled receptors promising therapeutic targets that play a role in many human diseases. On the day of cell passaging, coat each well of a black walled polystyrene 96-well plate with clear bottoms with 100 microliters of 0.1%gelatin solution and incubate the plates for two hours at room temperature. While the gelatin is solidifying, use a trypsin EDTA solution to lift the cells of interest from the bottom of their culture flask, resuspending the cells in fresh growth medium in a 50 milliliter conical tube once they have detached.After counting, collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in fresh growth medium to a one times 10 to the fifth viable cells per milliliter concentration. When the plates are ready, discard any excess gelatin solution and dry the plates on a lab tissue. Then wash the wells with 200 microliters of PBS and replace the wash with 200 microliters of cells per well for an overnight incubation at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.The next morning, tap the plate to discard the growth medium from the wells and dry the plate upside on a paper towel. Then label the cells in each well with 100 microliters of loading dye solution per well and incubate the plate for 45 minutes in the dark at room temperature. While the cells are incubating, add 75 microliters of CXCL12 per well to the chemokine plate and 50 microliters of the compound of interest to each well of the compound plate.Next, turn on the cooler unit of the fluorescence plate reader followed by the plate reader itself. After allowing the system a few minutes to initiate, open the plate reader software. To set up the assay protocol, under the settings tab select read mode and the appropriate excitation and emission wavelengths for the loading dye.Select the mix with transfer fluid tab for automatic mixing of the compounds in the compound plate. In the transfer fluid tab, set 20 microliters of each well from the compound plate to be transferred into the measurement plate and position the pipette tips at 20 microliters below the liquid surface. Set the speed of aspiration to 50 microliters per second and the speed of dispensing to 25 microliters per second and click read with transfer fluid.During the first interval, select 60 reads with a read interval time of one second with 10 reads to be recorded before the compounds are dispensed into the measurement plate and 50 reads to be completed after. Set the second interval with a read interval time of 30 seconds and 18 reads. Select three tip washes for the protocol, setting each wash step to include the appropriate wash fluid, one wash cycle, a fast pump speed, and five strokes per wash.Use the pause pipettor function to include the pipettor pause of 300 seconds and use the mix with transfer fluid setting to allow automatic mixing of the CXCL12 solution within the chemokine plate. In the subsequent transfer fluid tab, set 25 microliters from each well of the chemokine plate to be transferred to the measurement plate and position the tips 20 microliters below the liquid surface. Set the aspiration speed to 50 microliters per second and the dispensing speed to 25 microliters per second.Use the read with transfer fluid button to set the first interval to include 145 reads with a read interval time of one second. Set the second interval to a read interval time of six seconds and 20 reads. Select three more wash tip cycles.Then click set stage temperature and set the device temperature to 37 degrees Celsius. At the end of the loading dye incubation, discard the buffer from the measurement plate and dry the plate on a lab tissue. Wash the cells with 150 microliters per well of assay buffer replacing the buffer with 80 microliters of assay buffer after two minutes.Place the measurement plate in the read position, the compound plate at the source two position, the chemokine plate at the source three position, and a box of black tips at the source one position. Close the device and click protocol signal test to determine the background relative light units and fluorescence variance over the plate. Select test signal in the popup window.If background values of 8, 000 to 10, 000 relative light units are obtained, select update and click save to save the main protocol. Then push run to start the assay. In this graph, a dose-dependent increase in fluorescence correlating with the dose-dependent increase in the release of calcium can be observed.Increasing levels of CXCL12-induced fluorescence allow the generation of a dose response curve based on the difference between the minimum and maximum response over baseline between the first measurement after addition addition of the chemokine and the final measurement in the protocol. No fluorescent calcium-related response was evoked by CXCL12 even at a high concentration when cells lacking the corresponding functional chemokine receptor CXCR4 were used demonstrating the receptor specificity of the CXCL12-evoked measurement. A key application for this cell-based assay is to identify small molecules that, following pre-incubation, dose dependently inhibit CXCL12-induced calcium mobilization in the cells as compared to control non-active compounds that do not inhibit the response.To determine the inhibitory potency of small molecules, a dose response curve can be generated for the inhibitory molecules using nonlinear regression. This assay can be used to study other G protein-coupled receptors with no or only minimal further optimization as well as in this experiment in which a dose-dependent increase in fluorescence was observed when another chemokine receptor, CCR5, was stimulated with its natural chemokine agonist CCL5. Once mastered, this technique can be used to study many other G-protein coupled receptors that signal via the mobilization of intracellular calcium ions upon receptor activation.After watching this video, you should have a good understanding of how this cellular assay can be used to identify agonists and antagonists of the CXCL4 chemokine receptor.

Research

JoVE Journal

Medicine

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

そのような自閉症や統合失調症のような一般的な疾患でのde novo変異を同定するための戦略

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

医学

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

高塩ダイエットとルイスラットにおける慢性腎臓病を誘発するために一酸化窒素合成酵素阻害と組み合わせた5/6thの腎摘出

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

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