Name: a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators
Uploaded: 2018-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Eric Fonteyn y Geert Schoofs excelente asistencia técnica. Este trabajo ha sido apoyado por el KU Leuven (subsidio no. PF/10/018), el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, subsidio no. G.485.08) y la Fundación Dormeur Vaduz.

Nota: Todos los pasos descritos en las secciones 1 y 2 se llevan a cabo en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar.
1. mantenimiento de U87. Células CD4.hCXCR4
<ol><li>Crecen las células en T75 frascos de cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada. Nota: La línea de célula en vitro utilizada en este protocolo es una línea de células de glioblastoma U87 estable expresar el cúmulo de diferenciación 4 (CD4) y humanos CXCR4 y ha sid...

<ol>
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El Ca2 +-ensayo de movilización descrito anteriormente ha demostrado ser una herramienta valiosa para identificar y caracterizar a los antagonistas del receptor CXCR417de focalización. Es, sin embargo, anticipó que este método puede ser aplicado más generalmente a un grupo grande de otros GPCRs que desencadenan una citosólica Ca2 + liberación tras su activación, como se ilustra para el receptor del chemokine relacionados con CCR5. Mientras que en el caso de CCR5 podr?...

GPCRs son una superfamilia importante de proteínas de la superficie celular que activan cascadas de transducción de la señal al ligando extracelular. Pueden activarse por una gran variedad de estímulos incluyendo péptidos, hormonas proteicas, aminas biógenas y lípidos, que da lugar a la iniciación de diversas vías de señalización intracelular y respuestas biológicas eventualmente1,2 . Además, GPCRs participan en muchos, si no todos, los procesos fisiológicos y de desarrollo y muchas enfermedades humanas están asociadas con sobreexpresión de señalización o receptores GPCR disfuncional. GPCRs son por lo tanto entre los objetivos farmacológicos validados más en medicina1,3.
Por lo general, un flujo de trabajo de descubrimiento de drogas GPCR comienza con ensayos de proyección celular que permite la identificación de compuestos como moléculas pequeñas, anticuerpos monoclonales, péptidos que pueden modular la actividad de un particular GPCR. En el descubrimiento de la droga GPCR existen diferentes tipos de ensayos para buscar dichos compuestos, la mayoría de los cuales es compatible con campañas de proyección de rendimiento medio a alto. Los ensayos más usados incluyen experimentos de unión del receptor, fluorescencia o luminiscencia basado en análisis de detección de fluctuaciones en el nivel de supuestos mensajeros secundarios (p. ej., Ca2 +, monofosfato de adenosina cíclico (AMP)) fenotípicas ensayos de selección y reclutamiento de β-arrestin ensayos de4. La elección de un tipo particular de análisis puede depender de múltiples factores, pero también está determinada por el conocimiento previo de las propiedades de la señalización de un GPCR dado. Agonista a un GPCR induce un cambio conformacional que catalizan el intercambio de difosfato de guanidina (PIB) para el trifosfato de guanidina (GTP) en la subunidad α de las proteínas heterotriméricas G. Posteriormente la subunidad Gα-GTP se disocia de la subunidadβγ de G y ambas subunidades iniciará otras vías de señalización. Hidrólisis de la molécula de GTP y posterior re-Asociación de laαde la G / PIB y Gβγ subunidades restaurará la proteína G en su conformación inactiva5,6. Basado en la semejanza de la secuencia de la subunidadα G se definen diferentes tipos de proteínas G (GsGGq, G12/13)7. Señalización mediante elα de la G subunidad da lugar a varias respuestas típicas tales como el aumento (a través de Gs) o disminuir (via G) de la producción de AMP cíclico y Ca2 + movilización intracelular (via Gq)5 ,7. Gβγ subunidades también son capaces de inducir las vías efectoras intracelulares. Por ejemplo, en la activación de la G-GPCRs juntados, Gβγ pueden estimular directamente la fosfolipasa C (PLC-β) para producir trifosfato de inositol (IP3) que desencadena la liberación de Ca2 + intracelular tiendas7 . Tras la activación del receptor, GPCRs son fosforilados por las kinasas GPCR (GRKs) que promueve la interacción con β-arrestins. Este proceso termina G proteína de señalización y conduce a la internalización y la desensibilización del receptor. Β-arrestins también son capaces de formar complejos moleculares múltiples que pueden desencadenar otras vías de señalización independientes de la proteína G señalización8.
Dentro de la subfamilia de receptores del chemokine, la G-CXCR4 acoplado es un GPCR que ha levantado mucho interés como un prometedor objetivo de descubrimiento de fármacos. Dado su papel establecido como un co-receptor importante para virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) entrada viral e infección, compuestos dirigidos a CXCR4 se desarrollaron inicialmente como de los candidatos de drogas anti-VIH9. Más recientemente, un creciente cuerpo de evidencia ha señalado a un papel importante para CXCR4 en tumorigenesis y cáncer metástasis convirtiéndolo en un objetivo terapéutico validado en oncología, así10. CXCR4 es altamente expresada en más de veinte tipos de cáncer en humanos y controles tumor celular supervivencia, proliferación y migración así como angiogénesis tumorales10. Antagonistas CXCR4 de diferentes clases químicas previamente han sido descritas11,12, pero sólo la molécula pequeña que AMD3100 es actualmente aprobado para su uso en la clínica como un agente de movilización de células madre utilizado durante el tratamiento del linfoma y mieloma pacientes13,14. Los ensayos clínicos están en curso para evaluar la seguridad y la eficacia de varios otros antagonistas CXCR4 en diferentes enfermedades humanas, pero con un fuerte enfoque en oncología12. Habida cuenta de las muchas aplicaciones posibles para los antagonistas CXCR4, se justifica la búsqueda de nuevos compuestos con propiedades farmacocinéticas mejoradas, mejor biodisponibilidad o potencialmente menos efectos secundarios.
Aquí, un análisis cinético de celular basado en fluorescencia se utiliza principalmente para pantalla de compuestos capaces de inhibir la CXCR4 se describe. La medición fluorescente de este método se basa en el transitorio aumento de la Ca2 + concentración intracelular evocado en la activación de CXCR4 por su agonista endógeno, el ligando de la QUIMIOCINA CXCL12 (anteriormente conocido como células estromales derivan factor 1α ( SDF1-α)) y la potencial inhibición de esta CXCL12-inducida de Ca2 + respuesta de compuestos particulares. En este ensayo, se utilizan células de glioblastoma humano U87 estable expresando el receptor CXCR4 humano. Al mismo tiempo, estas células carecen de expresión endógena de CXCR7, un receptor de chemokine relacionados que también une CXCL1215,16,17. CXCR7 ha también ha demostrado previamente para ser capaces de formar heterodímeros con CXCR4, tal modo modulando las señalización características de este último receptor18. Fluctuaciones en el nivel intracelular Ca2 + mediada por CXCR4 son monitoreadas por la carga de la CXCR4+ células con éster de fluo-2 acetoxymethyl (AM), una afinidad alta permeable a la célula fluorescente Ca2 +-enlace colorante. Fluo-2 AM es una molécula fluorescente de longitud de onda única que puede ser excitada a 490 nm mientras que la fluorescencia de emisión se mide a 520 nm. Esta fluorescencia de emisión aumenta al Ca2 + enlace, con un amplio rango dinámico entre el Ca2 +-atado y desatado el estado. El aumento de la señal fluorescente es transitorio, que ocurre dentro de un intervalo de tiempo de unos pocos minutos y luego decaerá. La altura de la emisión fluorescente más correlaciona con el nivel de activación del receptor. El ensayo sí mismo se realiza mediante un lector de microplacas de fluorescencia equipado con una cámara CCD intensificado (ICCD) que posee un sistema de pipeteado integrado que permite la estandarización de los pasos de pipeteo en el análisis (véase Tabla de materiales) . Además, la medida simultánea de la señal fluorescente en todos los pocillos de una microplaca es otra ventaja clave del lector de fluorescencia que se utiliza. Durante la primera parte del análisis de los compuestos en investigación (por ejemplo, un grupo de pequeñas moléculas a una concentración fija o en una serie de diluciones) se agregan a la fluo-2 AM cargado CXCR4+ U87 células seguida de un ~ 10 minutos de incubación durante el cual el potencial efecto agonístico de los compuestos se mide continuamente en tiempo real. Entonces, el agonista endógeno (es decir, CXCL12) se agrega a las células para evocar un aumento transitorio en el nivel de Ca intracelular2 +CXCR4-mediated. Durante esta parte del análisis se puede evaluar la potencial actividad antagonista de los compuestos probados. Una descripción esquemática de flujo de trabajo general del ensayo se presenta en la figura 1.
Aunque este ensayo movilización de Ca2 + se ha utilizado principalmente para identificar y determinar la potencia inhibitoria de competencia antagonistas CXCR4 (es decir, compuestos que impiden que el agonista endógeno para enlazar y estimular el receptor), también puede identificar agonistas del receptor y, además, compuestos que ejercen su función uniéndose a sitios alostéricos (es decir, sitios que topográficamente el sitio de unión de orthosteric ocupado por el agonista endógeno). Ejemplos de esta última categoría de compuestos son agonistas alostéricos y PAMs y NAMs19,20. Mientras que los antagonistas específicos del receptor así como NAMs inhibiría la respuesta de CXCL12-inducida de Ca2 + , PAMs mejoraría esta respuesta ( véase también sección). Aunque el ensayo descritos específicamente objetivos CXCR4, se prevé que este método puede ser aplicado a otros GPCRs con esfuerzo mínimo de optimización, por lo menos si la señal a través de la liberación de Ca intracelular2 +.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluo-2 AM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142775</td>
			<td>fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMD3100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5602-5 mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maraviroc</td>
			<td>kind gift of AnorMed</td>
			<td></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CXCL12</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CCL5</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (T75)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plate, 96-well, clear bottom, with lid</td>
			<td>Costar/Fisher Scientific</td>
			<td>10530753</td>
			<td>assay plate (96-well), for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene (PP) plates</td>
			<td>Thermo Scientific (VWR)</td>
			<td>732-2661</td>
			<td>plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra high throughput cellular screening system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6128</td>
			<td>Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6203</td>
			<td>emission filter compatible with the fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra 96 Head</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0310-4536</td>
			<td>96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScreenWorks</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td>Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators

Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son de gran importancia para la industria farmacéutica ya que están implicados en muchas enfermedades humanas e incluyen objetivos bien validados para la intervención terapéutica. Descubrimiento de compuestos de plomo, incluyendo pequeñas moléculas sintéticas, que inhiben específicamente la función del receptor, es un paso inicial importante en el desarrollo de fármacos y se basa en ensayos de la célula sensibles, específicos y sólidos. Aquí, describimos un análisis celular cinético con una lectura fluorescente diseñada principalmente para identificar los antagonistas específicos de receptores que inhiben la Ca2 + liberación intracelular evocada la activación de los receptores de quimiocina CXC 4 (CXCR4) por su ligando endógeno, el ligando de quimiocina CXC 12 (CXCL12). Una ventaja clave de este método es que además, permite la detección de compuestos con propiedades agonistas intrínsecas (es decir, compuestos que un aumento de Ca2 + concentración intracelular en la ausencia de CXCL12) o compuestos modulación de la función del receptor vía la interacción con sitios de Unión alostérica (es decir, moduladores alostéricos positivos y negativos (PAMs y NAMs, respectivamente)). En el lado de abajo, autofluorescent compuestos interfieren con la lectura del ensayo, así dificultando la interpretación de datos confiable. Más probable es que este análisis pueden aplicarse, con adaptaciones mínimas, como un ensayo de descubrimiento de medicamentos genéricos para muchos otros GPCRs que la activación conduce a una liberación de Ca intracelular2 +.

El efecto de la estimulación de CXCL12 en el intracelular Ca2 + movilización en U87. CD4.CXCR4+ y U87. Las células CD4 se evaluó con el ensayo de Ca2 + movilización. En lugar de 20 μl de la sustancia de ensayo que normalmente se habrían agregado durante el primer paso de pipeteado del Protocolo (figura 1), tampón de ensayo se añadió a la fluo-2 AM cargado U87. CD4.CXCR4+ las células de la placa de medici?...

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A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.

Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

The overall goal of this cell-based assay is to identify and characterize molecules capable of stimulating or inhibiting G protein-coupled receptor-mediated intracellular calcium mobilization. This method can be a valuable assay for G protein-coupled receptor drug discovery because it can be used to screen for molecules that modify receptor-mediated intracellular calcium bodies. The main advantage of this technique is that it allows molecules with agonistic or antagonistic properties to be identified within the same assay.This assay may help in the discovery of novel drug candidates that act on G protein-coupled receptors promising therapeutic targets that play a role in many human diseases. On the day of cell passaging, coat each well of a black walled polystyrene 96-well plate with clear bottoms with 100 microliters of 0.1%gelatin solution and incubate the plates for two hours at room temperature. While the gelatin is solidifying, use a trypsin EDTA solution to lift the cells of interest from the bottom of their culture flask, resuspending the cells in fresh growth medium in a 50 milliliter conical tube once they have detached.After counting, collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in fresh growth medium to a one times 10 to the fifth viable cells per milliliter concentration. When the plates are ready, discard any excess gelatin solution and dry the plates on a lab tissue. Then wash the wells with 200 microliters of PBS and replace the wash with 200 microliters of cells per well for an overnight incubation at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.The next morning, tap the plate to discard the growth medium from the wells and dry the plate upside on a paper towel. Then label the cells in each well with 100 microliters of loading dye solution per well and incubate the plate for 45 minutes in the dark at room temperature. While the cells are incubating, add 75 microliters of CXCL12 per well to the chemokine plate and 50 microliters of the compound of interest to each well of the compound plate.Next, turn on the cooler unit of the fluorescence plate reader followed by the plate reader itself. After allowing the system a few minutes to initiate, open the plate reader software. To set up the assay protocol, under the settings tab select read mode and the appropriate excitation and emission wavelengths for the loading dye.Select the mix with transfer fluid tab for automatic mixing of the compounds in the compound plate. In the transfer fluid tab, set 20 microliters of each well from the compound plate to be transferred into the measurement plate and position the pipette tips at 20 microliters below the liquid surface. Set the speed of aspiration to 50 microliters per second and the speed of dispensing to 25 microliters per second and click read with transfer fluid.During the first interval, select 60 reads with a read interval time of one second with 10 reads to be recorded before the compounds are dispensed into the measurement plate and 50 reads to be completed after. Set the second interval with a read interval time of 30 seconds and 18 reads. Select three tip washes for the protocol, setting each wash step to include the appropriate wash fluid, one wash cycle, a fast pump speed, and five strokes per wash.Use the pause pipettor function to include the pipettor pause of 300 seconds and use the mix with transfer fluid setting to allow automatic mixing of the CXCL12 solution within the chemokine plate. In the subsequent transfer fluid tab, set 25 microliters from each well of the chemokine plate to be transferred to the measurement plate and position the tips 20 microliters below the liquid surface. Set the aspiration speed to 50 microliters per second and the dispensing speed to 25 microliters per second.Use the read with transfer fluid button to set the first interval to include 145 reads with a read interval time of one second. Set the second interval to a read interval time of six seconds and 20 reads. Select three more wash tip cycles.Then click set stage temperature and set the device temperature to 37 degrees Celsius. At the end of the loading dye incubation, discard the buffer from the measurement plate and dry the plate on a lab tissue. Wash the cells with 150 microliters per well of assay buffer replacing the buffer with 80 microliters of assay buffer after two minutes.Place the measurement plate in the read position, the compound plate at the source two position, the chemokine plate at the source three position, and a box of black tips at the source one position. Close the device and click protocol signal test to determine the background relative light units and fluorescence variance over the plate. Select test signal in the popup window.If background values of 8, 000 to 10, 000 relative light units are obtained, select update and click save to save the main protocol. Then push run to start the assay. In this graph, a dose-dependent increase in fluorescence correlating with the dose-dependent increase in the release of calcium can be observed.Increasing levels of CXCL12-induced fluorescence allow the generation of a dose response curve based on the difference between the minimum and maximum response over baseline between the first measurement after addition addition of the chemokine and the final measurement in the protocol. No fluorescent calcium-related response was evoked by CXCL12 even at a high concentration when cells lacking the corresponding functional chemokine receptor CXCR4 were used demonstrating the receptor specificity of the CXCL12-evoked measurement. A key application for this cell-based assay is to identify small molecules that, following pre-incubation, dose dependently inhibit CXCL12-induced calcium mobilization in the cells as compared to control non-active compounds that do not inhibit the response.To determine the inhibitory potency of small molecules, a dose response curve can be generated for the inhibitory molecules using nonlinear regression. This assay can be used to study other G protein-coupled receptors with no or only minimal further optimization as well as in this experiment in which a dose-dependent increase in fluorescence was observed when another chemokine receptor, CCR5, was stimulated with its natural chemokine agonist CCL5. Once mastered, this technique can be used to study many other G-protein coupled receptors that signal via the mobilization of intracellular calcium ions upon receptor activation.After watching this video, you should have a good understanding of how this cellular assay can be used to identify agonists and antagonists of the CXCL4 chemokine receptor.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Una estrategia para identificar mutaciones de novo en los trastornos comunes, tales como el autismo y la esquizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Investigación

Medicina

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th nefrectomía en combinación con dieta alta en sal y el óxido nítrico sintasa inhibición para inducir la enfermedad renal crónica en la rata Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

Una rata carótida lesión con el balón modelo para probar Terapéutica Remodelación Anti-vasculares

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias de las arterias y venas caninas

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Un ensayo clínico que evalúa la seguridad, eficacia y entrega de bolsas de tres cámaras basadas en aceite de oliva para la nutrición parenteral

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca2+ en miocitos de roedores

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...