Name: a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators
Uploaded: 2018-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

Yazarlar Eric Fonteyn ve Geert Schoofs mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser KU Leuven tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (iki, hayır vermek. G.485.08) ve Fondation Dormeur Vaduz.

Not: Bölüm 1 ve 2 altında açıklanan tüm adımları laminar akışı kabine steril koşullarda yapılmaktadır.
1. U87 bakım. CD4.hCXCR4 hücreleri
<ol><li>T75 kültür şişeler 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen kuluçka hücrelerinde büyür. Not: Bu protokol için kullanılan vitro hücre kültürünü stabil küme 4 farklılaşma (CD4) ve insan ifade bir U87 glioblastoma hücre çizgidir CXCR4 ve yukarıda açıklanan17oldu. CD4 ve CXCR4 hüc...

<ol>
	<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptors+in+the+human+genome+form+five+main+families.+Phylogenetic+analysis,+paralogon+groups,+and+fingerprints.">The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.</a> Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).</li><li>Lappano, R., Maggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors:+novel+targets+for+drug+discovery+in+cancer.">G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).</li><li>Milligan, G., Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G-proteins:+a+short+history.">Heterotrimeric G-proteins: a short history.</a> Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).</li><li>Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+G+protein+coupled+receptors.">Signaling through G protein coupled receptors.</a> Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).</li><li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+pathways.">G protein pathways.</a> Science. 296, 1636-1639 (2002).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+non-peptide+small+molecular+CXCR4+antagonists+as+anti-HIV+agents:+Recent+advances+and+future+opportunities.">Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities.</a> Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).</li><li>Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intricate+role+of+CXCR4+in+cancer.">The intricate role of CXCR4 in cancer.</a> Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).</li><li>Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibitors+of+CXCR4.">Small molecule inhibitors of CXCR4.</a> Theranostics. 3, 47-75 (2013).</li><li>Tsou, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+CXCR4+antagonists+in+stem+cell+mobilization,+HIV+infection,+ischemic+diseases,+and+oncology.">Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology.</a> Med Res Rev. , (2017).</li><li>Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plerixafor:+a+review+of+its+use+in+stem-cell+mobilization+in+patients+with+lymphoma+or+multiple+myeloma.">Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma.</a> Drugs. 71, 1623-1647 (2011).</li><li>DiPersio, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+prospective+randomized+double-blind+placebo-controlled+trial+of+plerixafor+plus+granulocyte+colony-stimulating+factor+compared+with+placebo+plus+granulocyte+colony-stimulating+factor+for+autologous+stem-cell+mobilization+and+transplantation+for+patients+with+non-Hodgkin's+lymphoma.">Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).</li><li>Balabanian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+assays+for+the+identification+and+evaluation+of+competitive+CXCR4+inhibitors.">Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors.</a> PLoS One. 12, e0176057 (2017).</li><li>Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+heterodimerizes+with+CXCR4+and+regulates+CXCL12-mediated+G+protein+signaling.">CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling.</a> Blood. 113, 6085-6093 (2009).</li><li>Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+paradigms+in+GPCR+allostery:+implications+for+drug+discovery.">Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).</li><li>Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+identification+of+allosteric+modulators+of+G-protein-coupled+receptors.">Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).</li><li>Hendrix, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety,+pharmacokinetics,+and+antiviral+activity+of+AMD3100,+a+selective+CXCR4+receptor+inhibitor,+in+HIV-1+infection.">Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).</li><li>Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicyclams,+a+class+of+potent+anti-HIV+agents,+are+targeted+at+the+HIV+coreceptor+fusin/CXCR-4.">Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4.</a> Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).</li><li>Perry, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc:+a+review+of+its+use+in+the+management+of+CCR5-tropic+HIV-1+infection.">Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection.</a> Drugs. 70, 1189-1213 (2010).</li><li>Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No-wash+dyes+for+calcium+flux+measurement.">No-wash dyes for calcium flux measurement.</a> Biotechniques. 34, 164-166 (2003).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+over-expression+and+survival+in+cancer:+a+system+review+and+meta-analysis.">CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis.</a> Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMD3100+story:+the+path+to+the+discovery+of+a+stem+cell+mobilizer+(Mozobil).">The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil).</a> Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).</li><li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activity+and+inverse+agonists+of+G+protein-coupled+receptors:+a+current+perspective.">Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective.</a> Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).</li><li>Kenakin, T., Miller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+receptors+as+shapeshifting+proteins:+the+impact+of+allosteric+modulation+and+functional+selectivity+on+new+drug+discovery.">Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).</li><li>Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+GPCRs:+a+novel+approach+for+the+treatment+of+CNS+disorders.">Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).</li><li>Burford, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+positive+allosteric+modulators+and+silent+allosteric+modulators+of+the+mu-opioid+receptor.">Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).</li><li>Bartfai, T., Wang, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+allosteric+modulators+to+peptide+GPCRs:+a+promising+class+of+drugs.">Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs.</a> Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).</li><li>Hatse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+CXCL12AF647+as+a+novel+probe+for+nonradioactive+CXCL12/CXCR4+cellular+interaction+studies.">Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies.</a> Cytometry A. 61, 178-188 (2004).</li><li>Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activity+of+G-protein-coupled+receptors:+cause+of+disease+and+common+property+of+wild-type+receptors.">Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).</li><li>Zhang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+that+confers+constitutive+activity+to+CXCR4+reveals+that+T140+is+an+inverse+agonist+and+that+AMD3100+and+ALX40-4C+are+weak+partial+agonists.">A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists.</a> J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).</li><li>Tamamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-molecular-weight+inhibitor+against+the+chemokine+receptor+CXCR4:+a+strong+anti-HIV+peptide+T140.">A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140.</a> Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).</li><li>Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).</li></ol>

Ca2 +-burada açıklanan seferberlik tahlil tanımlamak ve CXCR417hedefleme reseptör antagonistleri karakterize etmek için değerli bir araç olarak daha önce gösterildi. Ancak, bu yöntem daha genel olarak bir sitozolik Ca2 + serbest bırakılmasıyla onların harekete geçirmek, tetikler diğer GPCRs büyük bir grup için ilgili Kemokin reseptör CCR5 gösterildiği gibi uygulanabilir olduğunu tahmin edilmektedir. CCR5 durumunda tam olarak aynı deneysel koşullar uyg...

GPCRs önemli bir üst aile cep yüzey proteinlerin sinyal iletim cascades ekstraselüler ligand taşıması üzerine harekete geçirmek vardır. Çeşitli hücre içi sinyal yolları ve sonunda biyolojik yanıt-e doğru1,2 başlatma sonuçları uyaranlara peptidler, protein hormonlar, Biojenik aminler ve lipidler, dahil olmak üzere büyük bir çeşitlilik tarafından etkinleştirilebilir . Ayrıca, GPCRs birçok, eğer tüm, gelişimsel ve fizyolojik süreçler söz konusu ve birçok insan hastalıkları işlevsiz GPCR sinyal veya reseptör overexpression ile ilişkilidir. GPCRs bu nedenle tıp1,3en doğrulanmış farmakolojik hedefler arasında bulunmaktadır.
Genellikle, küçük moleküller, Monoklonal antikor ve belirli bir GPCR etkinlik modüle peptidler gibi bileşiklerin kimliği etkinleştirme hücresel tarama deneyleri GPCR ilaç keşif iş akışı başlar. GPCR ilaç keşfi, böyle bileşikler için aramak için farklı türlerde deneyleri mevcut olan en orta - için yüksek-den geçerek tarama kampanyaları ile uyumludur. En çok kullanılan deneyleri reseptör bağlama deneyler, dahil floresan veya ışıldama göre sözde ikincil haberci (örneğin, Ca2 +, siklik adenozin monofosfattır (AMP)), fenotipik düzeyde dalgalanması tespit deneyleri tarama testleri ve β-arrestin işe alım deneyleri4. Tahlil belirli bir türü için seçim birden fazla faktöre bağlı olabilir, ama aynı zamanda belirli bir GPCR sinyal özellikleri ile ilgili ön bilgi tarafından belirlenir. Bir GPCR bağlama agonist guanidin nükleotittir (GSYİH) guanidin trifosfat (GTP) için exchange katalizlerler konformasyonal değişim α-alt heterotrimeric G protein neden olmaktadır. Daha sonra Gα-GTP alt birimi Gβγ alt birimi ayrışıp ve her iki alt birimleri daha fazla sinyal yolları başlatacaktır. Hidroliz GTP-molekül ve sonraki yeniden Derneği Gα- GSYİH ve Gβγ alt birimleri gr protein onun etkin olmayan uyum5,6geri yükler. Dayalı sıra Gα alt birim benzerliğini G proteinlerin farklı türleri tanımlanmıştır (Gs,benG, Gq, G12/13)7. Via Gα sinyal alt birimi verir artış artış gibi birkaç tipik yanıt için (Gs) veya (Gben) siklik AMP üretim ve intrasellüler Ca2 + seferberlik (yolu ile Gq) azaltmak5 ,7. Gβγ alt birimleri Ayrıca hücre içi efektör yolları ikna edebiliyoruz. Örneğin,benG aktivasyonu üzerine-eşleşmiş GPCRs, Gβγ doğrudan fosfolifaz açıklaması, Ca2 + hücre içi mağazaları7 tetikleyen C (PLC-β) inositol trifosfat (IP3) üretmek için teşvik . Reseptör aktivasyonu, β-arrestins ile etkileşimi teşvik GPCR kinaz (GRKs) tarafından GPCRs fosforile. Bu işlem G protein sinyal sonlandırır ve reseptör duyarsızlaştırma ve sonunda içselleştirilmesi yol açar. Β-arrestins da diğer sinyal yolları8sinyal G protein bağımsız tetikleyebilir çok moleküler komplekslerin oluşturmak edebiliyoruz.
Kemokin reseptörleri, Gbenalt familya içinde-eşleşmiş CXCR4 çok ilgi ilaç keşfi için umut verici hedef olarak yükseltti GPCR olduğunu. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) 1 için büyük bir co reseptör olarak kurulan rolünü verilen viral giriş ve enfeksiyon, CXCR4 hedefleme bileşikler başlangıçta Anti-HIV ilaç adayları9olarak geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, kanıt büyüyen bir vücut için önemli bir rol CXCR4 için yapım o iyi doğrulanmış bir terapötik hedef Onkoloji de tumorigenesis ve kanser metastaz içinde10işaret etmiştir. CXCR4 son derece insan kanseri ve denetimleri tümör hücre sağkalım, nükleer silahların yayılmasına karşı ve geçiş yanı sıra angiogenez tümör ile ilgili10yirmiden fazla türünde de ifade edilir. Farklı kimyasal sınıfların CXCR4 antagonistleri daha önce açıklanan11,12, ama sadece küçük molekül AMD3100 şu anda Lenfoma tedavi sırasında kullanılan kök hücre seferberlik ajan olarak klinikte kullanımı için onaylanan olmuştur ve Miyelom hastaları13,14. Klinik çalışmalarda emniyet ve birkaç diğer CXCR4 antagonistleri farklı insan hastalıkları, ama Onkoloji12güçlü bir odaklanma ile etkinliğini değerlendirmek için devam etmektedir. Birçok potansiyel uygulama CXCR4 antagonistleri için göz önüne alındığında, geliştirilmiş farmakokinetik özellikleri, Gelişmiş bioavailability veya potansiyel olarak daha az yan etkileri ile roman bileşikler için arama garanti kapsamındadır.
Burada, Kinetik bir floresan tabanlı hücresel tahlil için öncelikle kullanılan ekran CXCR4 inhibe yeteneğine sahip bileşikler için açıklanmıştır. Bu yöntemin floresan ölçüm CXCR4 harekete geçirmek onun endojen agonist Kemokin ligand (stromal hücre türetilmiş gibi faktör 1α (eski adıyla CXCL12 tarafından uyarılmış intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu geçici artış dayanır SDF1-α)) ve bu CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt tarafından belirli bileşikler potansiyel inhibisyonu. Bu tahlil U87 insan glioblastoma hücreler stabil insan CXCR4 reseptör ifade kullanılır. Aynı zamanda, bu hücreler CXCR7, ayrıca CXCL1215,16,17bağlar ilgili Kemokin reseptör endojen ifade eksikliği. CXCR7 daha önce de heterodimers CXCR4 ile şekillendirme yeteneğine sahip olması dolayısıyla bu ikinci reseptör18sinyal özelliklerini oransal gösterilmiştir. Düzeyi tarafından CXCR4 aracılı hücre içi Ca2 + dalgalanmalar CXCR4 yükleyerek izlenir+ hücreleri ile fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, bir hücre geçirgen yüksek afinite floresan Ca2 +-boya bağlama. Fluo-2 490 heyecanlı bir tek dalga boyu floresan molekül olduğu kendi emisyon Floresans 520 ölçülür ise nm nm. Ca2 + bağlama, büyük bir Dinamik Aralık arasında Ca2 +ile üzerine bu emisyon Floresans artırır-bağlı ve devlet ilişkisiz. Floresan sinyal artış geçicidir, birkaç dakika, bir zaman aralığında meydana gelen ve daha sonra çürük. Floresan emisyon daha fazla ilişkilendirir pik yüksekliği reseptörü harekete geçirmek düzeyine sahip. Tahlil kendisi tahlil pipetting adımları standardizasyonu sağlayan entegre bir pipetting sistem sahip bir yoğun CCD (ICCD) kamera ile donatılmış bir floresan Mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek) . Buna ek olarak, aynı anda bir Mikroplaka bütün Wells floresan sinyal kullanılır Floresans okuyucu bir diğer önemli avantajı ölçümdür. İlk soruşturma (örneğin, sabit bir konsantrasyon veya bir seyreltme dizisinde küçük moleküllerin bir panel) altında bileşikler fluo-2 AM eklendi tahlil bir parçası CXCR4 yüklenen+ U87 hücreleri tarafından izlenen bir ~ 10 dk kuluçka dönemi sırasında gerçek zamanlı olarak sürekli bileşikler potansiyel agonistik etkisi ölçülür. O zaman, endojen agonist (örneğin, CXCL12) hücrelere bir CXCR4 aracılı geçici düzeyinde artış intrasellüler Ca2 +uyandırmak eklenir. Bu testin bir parçası sırasında test edilen bileşiklerin potansiyel antagonistik etkinlik değerlendirilebilir. Tahlil'ın genel iş akışı şematik bir bakış şekil 1' de sunulmuştur.
Bu Ca2 + seferberlik tahlil öncelikle tanımlamak ve rekabetçi CXCR4 antagonistleri (Yani, bağlama ve reseptör teşvik endojen agonist önlemek bileşikler), inhibitör potens belirlemek için yolculuklarında uygulanmış olsa o da reseptör agonistleri belirleyebilir ve buna ek olarak, maddeler ve birleşimler işlevlerine göre bağlama (Yani, arazi endojen agonist tarafından işgal orthosteric bağlama site farklı siteleri) allosteric sitelerdeki uygulamayın. Allosteric agonistleri ve PAMs ve NAMs19,20ikinci kategoriye bileşiklerin örnekleridir. NAMs yanı sıra özel reseptör antagonistleri CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt inhibe ise, PAMs bu yanıtı artıracak (Ayrıca bkz: tartışma bölümü). Tahlil burada özellikle hedefleri CXCR4 açıklanan rağmen bu yöntem en az optimizasyonu çaba ile diğer GPCRs için en az uygulanabilir öngörülmektedir intrasellüler Ca2 +serbest bırakmak yolu ile isaret edersem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluo-2 AM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142775</td>
			<td>fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMD3100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5602-5 mg</td>
			<td>specific CXCR4 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maraviroc</td>
			<td>kind gift of AnorMed</td>
			<td></td>
			<td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CXCL12</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemokine ligand CCL5</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (T75)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black plate, 96-well, clear bottom, with lid</td>
			<td>Costar/Fisher Scientific</td>
			<td>10530753</td>
			<td>assay plate (96-well), for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene (PP) plates</td>
			<td>Thermo Scientific (VWR)</td>
			<td>732-2661</td>
			<td>plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra high throughput cellular screening system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6128</td>
			<td>Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0200-6203</td>
			<td>emission filter compatible with the fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Tetra 96 Head</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>0310-4536</td>
			<td>96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScreenWorks</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>cell viability analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3340</td>
			<td>Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a kinetic fluorescence-based ca2+ mobilization assay to identify g protein-coupled receptor agonists, antagonists, and allosteric modulators

Onlar birçok insan hastalıkları içinde yer alan ve terapötik müdahale için iyi doğrulanmış hedefleri içerir gibi ilaç endüstrisi için büyük önem G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) vardır. Keşif kurşun bileşikleri, özellikle reseptör'ın işlevi inhibe, küçük sentetik moleküller de dahil olmak üzere uyuşturucu gelişiminde önemli bir ilk adımdır ve hassas, belirli ve güçlü hücre tabanlı deneyleri üzerinde dayanır. Burada, biz Kinetik bir hücresel tahlil ile öncelikle CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) etkinleştirme uyarılmış intrasellüler Ca2 + serbest inhibe özel reseptör antagonistleri tanımlamak için tasarlanmış bir floresan okuma tarafından açıklamak onun endojen ligand CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12). Ayrıca tarama Iç agonistik özellikleri (örneğin, intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu yokluğunda CXCL12 bir artış alabilme bileşikleri) veya bileşikler ile donatılmış bileşiklerin sağlar Bu yöntemin önemli bir avantajı olduğunu reseptör'ın işlevi allosteric bağlayıcı siteleri ile etkileşim yoluyla oransal (Yani, pozitif ve negatif allosteric modülatörler (PAMs ve NAMs, sırasıyla)). Aşağı tarafta, autofluorescent bileşikler böylece güvenilir veri yorumu engelleyici tahlil'ın okuma ile etkileşebilir. Büyük olasılıkla bu tahlil, en az uyarlamalar ile jenerik ilaç keşif tahlil için birçok diğer GPCRs hangi bir intrasellüler Ca2 +serbest bırakmak için belgili tanımlık harekete geçirmek yol olarak uygulanabilir.

CXCL12 uyarım intrasellüler Ca2 + mobilizasyon U87 üzerinde etkisi. CD4.CXCR4+ ve U87. CD4 hücreleri Ca2 + seferberlik tahlil ile değerlendirilmesi. Yerine 20 µL normalde Protokolü (şekil 1) pipetting ilk adımında eklendi test bileşik tahlil arabellek eklendi fluo-2 AM U87 yüklü. CD4.CXCR4+ hücrelerde ölçüm plaka. İkinci dağıtım adımı, CXCL12 farklı konsantrasyonları (0.2-102,4 nM, son konsa...

Watch this Scientific Journal Video about A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators at JoVE.com

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

The overall goal of this cell-based assay is to identify and characterize molecules capable of stimulating or inhibiting G protein-coupled receptor-mediated intracellular calcium mobilization. This method can be a valuable assay for G protein-coupled receptor drug discovery because it can be used to screen for molecules that modify receptor-mediated intracellular calcium bodies. The main advantage of this technique is that it allows molecules with agonistic or antagonistic properties to be identified within the same assay.This assay may help in the discovery of novel drug candidates that act on G protein-coupled receptors promising therapeutic targets that play a role in many human diseases. On the day of cell passaging, coat each well of a black walled polystyrene 96-well plate with clear bottoms with 100 microliters of 0.1%gelatin solution and incubate the plates for two hours at room temperature. While the gelatin is solidifying, use a trypsin EDTA solution to lift the cells of interest from the bottom of their culture flask, resuspending the cells in fresh growth medium in a 50 milliliter conical tube once they have detached.After counting, collect the cells by centrifugation and resuspend the pellet in fresh growth medium to a one times 10 to the fifth viable cells per milliliter concentration. When the plates are ready, discard any excess gelatin solution and dry the plates on a lab tissue. Then wash the wells with 200 microliters of PBS and replace the wash with 200 microliters of cells per well for an overnight incubation at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.The next morning, tap the plate to discard the growth medium from the wells and dry the plate upside on a paper towel. Then label the cells in each well with 100 microliters of loading dye solution per well and incubate the plate for 45 minutes in the dark at room temperature. While the cells are incubating, add 75 microliters of CXCL12 per well to the chemokine plate and 50 microliters of the compound of interest to each well of the compound plate.Next, turn on the cooler unit of the fluorescence plate reader followed by the plate reader itself. After allowing the system a few minutes to initiate, open the plate reader software. To set up the assay protocol, under the settings tab select read mode and the appropriate excitation and emission wavelengths for the loading dye.Select the mix with transfer fluid tab for automatic mixing of the compounds in the compound plate. In the transfer fluid tab, set 20 microliters of each well from the compound plate to be transferred into the measurement plate and position the pipette tips at 20 microliters below the liquid surface. Set the speed of aspiration to 50 microliters per second and the speed of dispensing to 25 microliters per second and click read with transfer fluid.During the first interval, select 60 reads with a read interval time of one second with 10 reads to be recorded before the compounds are dispensed into the measurement plate and 50 reads to be completed after. Set the second interval with a read interval time of 30 seconds and 18 reads. Select three tip washes for the protocol, setting each wash step to include the appropriate wash fluid, one wash cycle, a fast pump speed, and five strokes per wash.Use the pause pipettor function to include the pipettor pause of 300 seconds and use the mix with transfer fluid setting to allow automatic mixing of the CXCL12 solution within the chemokine plate. In the subsequent transfer fluid tab, set 25 microliters from each well of the chemokine plate to be transferred to the measurement plate and position the tips 20 microliters below the liquid surface. Set the aspiration speed to 50 microliters per second and the dispensing speed to 25 microliters per second.Use the read with transfer fluid button to set the first interval to include 145 reads with a read interval time of one second. Set the second interval to a read interval time of six seconds and 20 reads. Select three more wash tip cycles.Then click set stage temperature and set the device temperature to 37 degrees Celsius. At the end of the loading dye incubation, discard the buffer from the measurement plate and dry the plate on a lab tissue. Wash the cells with 150 microliters per well of assay buffer replacing the buffer with 80 microliters of assay buffer after two minutes.Place the measurement plate in the read position, the compound plate at the source two position, the chemokine plate at the source three position, and a box of black tips at the source one position. Close the device and click protocol signal test to determine the background relative light units and fluorescence variance over the plate. Select test signal in the popup window.If background values of 8, 000 to 10, 000 relative light units are obtained, select update and click save to save the main protocol. Then push run to start the assay. In this graph, a dose-dependent increase in fluorescence correlating with the dose-dependent increase in the release of calcium can be observed.Increasing levels of CXCL12-induced fluorescence allow the generation of a dose response curve based on the difference between the minimum and maximum response over baseline between the first measurement after addition addition of the chemokine and the final measurement in the protocol. No fluorescent calcium-related response was evoked by CXCL12 even at a high concentration when cells lacking the corresponding functional chemokine receptor CXCR4 were used demonstrating the receptor specificity of the CXCL12-evoked measurement. A key application for this cell-based assay is to identify small molecules that, following pre-incubation, dose dependently inhibit CXCL12-induced calcium mobilization in the cells as compared to control non-active compounds that do not inhibit the response.To determine the inhibitory potency of small molecules, a dose response curve can be generated for the inhibitory molecules using nonlinear regression. This assay can be used to study other G protein-coupled receptors with no or only minimal further optimization as well as in this experiment in which a dose-dependent increase in fluorescence was observed when another chemokine receptor, CCR5, was stimulated with its natural chemokine agonist CCL5. Once mastered, this technique can be used to study many other G-protein coupled receptors that signal via the mobilization of intracellular calcium ions upon receptor activation.After watching this video, you should have a good understanding of how this cellular assay can be used to identify agonists and antagonists of the CXCL4 chemokine receptor.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Ortak Bozuklukları de Novo Mutasyonlar, otizm ve şizofreni gibi tanımlayın Bir Strateji

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Tıp

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Yüksek Tuz Diyet ve Lewis Rat Kronik Böbrek Hastalığı tetikleyebilecek Nitrik Oksit Sentaz inhibisyonu ile bağlantılı 5/6th nefrektomi

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

Rat Karotis Balon Yaralanma Modeli Anti-vasküler Tadilat Therapeutics Test

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Parenteral Beslenme için Zeytinyağı Bazlı Üç Odalı Poşetlerin Güvenliğini, Etkinliğini ve Teslimini Değerlendiren Klinik Bir Çalışma

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

İnsan Bağırsak Organoidlerinde Lipid Damlacık Oluşumunun Karakterizasyonu ve Niceliği için Floresan Esaslı Bir Test

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...