Name: the mouse hindbrain as a model for studying embryonic neurogenesis
Uploaded: 2018-01-29T13:30:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis at JoVE.com

Мы благодарим Василики Chantzara для проведения запланированных вязки и сотрудники группы биологических ресурсов в UCL Института офтальмологии для мыши животноводства. Это исследование было поддержано Уэллком доверять следователь награду 095623/Z/11/Z для CR.

<ol>
	<li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes.">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li><li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTF/LIF/gp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain.">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li><li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eomes::GFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast,+primitive+streak,+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo.">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).</li><li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Genes+and+the+Hindbrain:+A+Study+in+Segments.">Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+mouse+hindbrain+as+a+qualitative+and+quantitative+model+for+studying+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+angiogenesis.">The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis.</a> Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).</li><li>Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+from+hindbrain+boundaries+regulates+neuronal+clustering+that+patterns+neurogenesis.">Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis.</a> Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).</li><li>Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-9+controls+the+timing+of+neurogenesis+through+the+direct+inhibition+of+antagonistic+factors.">miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors.</a> Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).</li><li>Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tgfbeta+signaling+regulates+temporal+neurogenesis+and+potency+of+neural+stem+cells+in+the+CNS.">Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS.</a> Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).</li><li>Jacob, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+acid+specifies+neuronal+identity+through+graded+expression+of+Ascl1.">Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1.</a> Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).</li><li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube.">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).</li><li>Peretz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+role+of+hindbrain+boundaries+as+pools+of+neural+stem/progenitor+cells+regulated+by+Sox2.">A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2.</a> BMC Biol. 14, 57 (2016).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li><li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Hutton, S. R., Pevny, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+expression+levels+distinguish+between+neural+progenitor+populations+of+the+developing+dorsal+telencephalon.">SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon.</a> Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).</li><li>Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbr2+directs+conversion+of+radial+glia+into+basal+precursors+and+guides+neuronal+amplification+by+indirect+neurogenesis+in+the+developing+neocortex.">Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex.</a> Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).</li><li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type.">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nat Commun. 4, 2125 (2013).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages+act+as+cellular+chaperones+for+vascular+anastomosis+downstream+of+VEGF-mediated+endothelial+tip+cell+induction.">Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction.</a> Blood. 116 (5), 829-840 (2010).</li><li>Kayam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Pax6+in+the+segmental+organization+of+the+hindbrain.">A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain.</a> Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).</li><li>Tata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+embryonic+neurogenesis+by+germinal+zone+vasculature.">Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).</li></ol>

Никто из авторов у конкурирующих или противоречивых интересов.

Этот протокол описывает, как использование эмбриональных задний мозг мыши как модель для изучения механизмов развития нейрогенез. С помощью различных методов различных immunolabeling, задний мозг NPC могут быть визуализированы, и их число количественно в разделах ткани или органа wholemounts. Простота диссекции и плоские анатомии гарантирует, что задний мозг может отражаться в подготовке «открытая книга» для сбора информации на нейрогенез орган всей модели.
Далее мы покажем, что NPC морфологии и связанных с клеточного цикла NPC позиционирования могут быть легко визуализированы в плавающей- или cryosections задний мозг. Обе поведения может быть использована для определения новых прародитель населения, как ранее было выполнено в млекопитающих конечного мозга20. К примеру раннем образована Sox2+ neuroepithelia и апикального радиальной глии Pax6+ присутствуют в задний мозг21,22, но задний мозг не хватает базальной прародителями Tbr2+ 3 .
Протокол, описанные здесь, также может быть адаптирована к наблюдать за поведением определенных NPC субпопуляций, люминесцентные маркировки для живых изображений и/или линии трассировки в фиксированных тканей. Это может быть достигнуто, например, изучая hindbrains от мышей, перевозящих тамоксифен индуцибельной трансген Sox1-iCreERT2 и Rosa26tdTomato репортер23.
Помимо повышения знаний о мышиных нейрогенез, изучая задний мозг может прояснить широко соответствующие нейрогенный механизмы, которые являются общими для всех видов, потому что задний мозг является весьма сохранены мозга регионе, которая, как ожидается, будет больше похож между позвоночных видов чем переднего мозга.
Как задний мозг нейрогенез происходит за сравнительно короткий интервал времени чем переднего нейрогенез23, важно рассмотреть вопрос о необходимости для сравнения адекватно устроили эмбрионов. Соответственно экспериментальные предвзятости избегается путем подсчета и записи числа Сомит пар в эмбрион до изоляции его задний мозг. Самой ткани задний мозг является хрупким и щипцами должны поэтому рассматриваться тщательно отделяя задний мозг ткани от головы мезенхимы и мозговых оболочек; несколько «практика работает» поэтому может быть целесообразно перед попыткой рассечение ценных эмбрионов. Кроме того hindbrains должны быть переданы из одной трубы в другой с помощью пипетки Пастера широкий родила, а не щипцов, чтобы избежать повреждения (Пипетка открытия можно увеличилась на режущий кончик с чистой ножницами). Наконец хотя редко, степень включения EdU/BrdU в S-фазе NPC может быть переменной, в частности во время коротких (т.е., 1 ч) импульсов. Для улучшения маркировки, убедитесь, что EdU/BrdU должным образом расторгнут перед загрузкой раствор в шприц и тщательно привнести в брюшной полости. Бедные инъекции, например подкожно, случайно, приведет к потери или захвата EdU/BrdU решение и предотвратить его попадание кровообращение.

Во время эмбрионального развития млекопитающих НИПы разделить желудочков (VZ) и субвентрикулярной зоны (SVZ) нейроэпителия расширение для создания новых нейронов в процесс называется «нейрогенез». Поколение новых нейронов и их прекурсоров NPC широко исследована в переднего1, пока меньше известно об этом процессе в других регионах.
Мозга является сложной и сложной сложил структура, во многом учился с гистологических методов после разрезания ткани, что делает понимание нейрогенез шаблонов через весь орган сложной. Кроме того исследования переднего нейрогенез не обязательно прогнозирования нейрогенный поведения в других регионах мозга или спинного мозга. Например сигнализации, что сигналы могут выявить различные ответы в различных регионах ЦНС, как отмечено в случае цилиарной нейротрофических факторов и лейкемия ингибирующего фактора, которые способствуют самообновлению НИПы в боковые Ганглиозный возвышение, но диск дифференциация спинного прародителями2. Кроме того, отсутствуют суб класс NPCs, которые заполняют развивающегося мозга и в значительной степени способствовать расширению коре1 задний мозг и спинной мозг3. Наоборот это мыслимо, что спинного мозга и задний мозг содержат альтернативные NPC подтипы не присутствует в коре головного мозга.
Задний мозг зародыша мыши эволюционной старейший район млекопитающих мозга и генерирует мозжечка и ствола мозга. Несмотря на его сохранения видов относительно мало известно о задний мозг нейрогенез, включая подтипы NPC или их регулирования. Большинство исследований задний мозг мыши была сосредоточена на процесс сегментации ткани, движимый гомеозисных генов4и структурирования пост митотическая нейронов5. Кроме того как модель для изучения механизмов развития ангиогенеза6использовался задний мозг.
В отличие от мыши задний мозг данио рерио задний мозг широко используется NPC дифференциации и линии прогрессии в организме позвоночных модель (например,,78). Задний мозг куриных также были использованы для изучения нейрогенез во время позвоночных разработки (например,9,10). Подобно данио рерио задний мозг11, куриных задний мозг может быть живой образ для изучения поведения NPC и регулирование в течение времени12. Наблюдением живой изображений аналогичные продольной возможен не в настоящее время в организмах млекопитающих, потому, что они разрабатывают внутриутробно. Кроме того целевые манипуляции через методы, такие как электропорации могут быть легко применены Свободноживущие zebrafish эмбриона или куриных эмбрионов в ovo (например,13), но такие методы являются также более сложным в внутриутробно.
Тем не менее задний мозг зародыша мыши изысканно подходит определение молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют нейрогенез. Во-первых анализ задний мозг мыши во многих случаях, предоставит информацию, более актуальными для людей события чем получены путем изучения Нижняя позвоночных. Кроме того, огромное количество штаммов генетически модифицированные мыши доступны что может либо использоваться для сопоставления мышиных НИПы судьбы или изменить механизмы регулирования с учредительных или условного мутантные аллели соответствующих генов. Наконец, он недавно было показано, что микроинъекции желудочков задний мозг прародителями ex vivo позволяет по крайней мере краткий анализ задний мозг NPC кинетики14. Тем не менее, в настоящее время, очень мало известно о пространственно-временных Организации и поведение задний мозг НИПы в контексте всего органа.
Здесь мы показываем, простой и быстрый способ использовать задний мозг как мощная модель для анализа млекопитающих поведение NPC в разделах ткани и wholemount препараты. Мы далее предоставляют протоколы для использования immunolabeling для изучения параметров различных Нейрогенез и процесс задний мозг образцы далее вниз по течению молекулярной приложений таких количественных обратной транскриптазы (qRT)-PCR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">211-2120</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Plastic cell culture dish, 60 mm</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150288</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Cell culture plates, 12-well</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150628</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:97px;">Copan</td>
			<td style="width:119px;">200C</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 55</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td>11295-51</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">29G needle/syringe</td>
			<td style="width:97px;">BD</td>
			<td>BD Micro-Fine +1ml</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-phospho-histone H3 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td style="width:291px;">Goat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Anti-BrdU primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td style="width:291px;">Rat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-Ki67 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td style="width:291px;">Mouse, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:257px;">Anti-RC2 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>RC2</td>
			<td style="width:291px;">Mouse (IgM), dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11029</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11037</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A21042</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11007</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:291px;">Use at 10 &#956;g per mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">900584</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-bromo-2&#180;-deoxyuridine (BrdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B5002</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">DAKO protein-block serum free</td>
			<td style="width:97px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">X0909</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9876</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sucrose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Super PAP pen liquid blocker</td>
			<td style="width:97px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">22309</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">SlowFade Antifade Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S-2828</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Glycerol</td>
			<td style="width:97px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10337700</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Mowiol</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475904</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">OCT</td>
			<td style="width:97px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Isopentane</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Methanol</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10675112</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10316380</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0912</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0108</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Thermometer</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">620-0858</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Cover glass</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0137</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:97px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:97px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse hindbrain as a model for studying embryonic neurogenesis

Переднего мозга эмбриона мыши является наиболее часто работающие системы для изучения млекопитающих нейрогенез во время разработки. Однако очень складчатые переднего neuroepithelium не поддается wholemount анализ для изучения нейрогенез орган всей модели. Кроме того определение механизмов нейрогенез переднего мозга не обязательно прогнозировать нейрогенез в других частях мозга; Например, благодаря наличию переднего конкретных прародитель подтипы. Задний мозг мыши обеспечивает альтернативную модель для изучения эмбриональных нейрогенез, которая поддается wholemount анализа, а также разделов ткани соблюдать пространственно-временных распределения и поведение нейронных прародителей. Кроме того он легко расчлененные для других нисходящие приложения, такие как анализ изоляции или молекулярной биологии клетки. Как задний мозг мыши могут легко анализироваться в огромное количество клеток линии репортер и мыши мутантных штаммов, которые стали доступны, он предлагает мощную модель для изучения молекулярных и клеточных механизмов развития нейрогенез в млекопитающих организм. Здесь мы представляем простой и быстрый метод, чтобы использовать задний мозг зародыша мыши для анализа поведения млекопитающих нейронных прародитель клеток (NPC) в подготовке wholemount и разделах ткани.

Этот раздел иллюстрирует примеры результатов, которые могут быть получены при изучении нейрогенез в эмбриональных задний мозг мыши через wholemount и ткани раздел анализа.
Мы покажем что wholemount immunolabeling microdissected задний мозг с антитело для митотическая маркер pHH3 визуализирует деления НИПы в VZ (Рисунок 2B – D). Мы показываем pHH3+ НПС с высоким увеличением выделить различные этапы митоза (рис. 2 c). Мы показывали этот обозначая метод подходит для выполняться на несколько последовательных этапов развития задний мозг соблюдать время курс ВСНП митоз в этом органе (Рисунок 2D).
Мы покажем, что визуализации поперечных полученных vibratome разделы задний мозг 1 ч после инъекции Эду, визуализирует расщепления ориентации митотическая РНУ (рисунок 3B), псевдомногослойный, interkinetic миграции ядерного модель Велоспорт прародителями18 (рисунок 3B, D) и общая структура VZ ( Dрисунок 3B – ). Обратите внимание, что митотическая pHH3+ НПС присутствуют только на поверхности желудочков и не более basally (рис. 3 c), которая контрастирует базальной отдел шаблон более совершенные РНУ в переднего19.
Мы также иллюстрируют, как велосипедные НПС и их дифференцированной потомства могут быть помечены с BrdU или EdU оценить NPC линии прогрессии (рис. 4). Immunolabeling поперечной cryosections задний мозг мыши 1 день после инъекции BrdU BrdU и Ki67показывает число и расположение Велоспорт НИПы в neuroepithelium (рис. 4A, B), согласно которой количество само обновление NPC могут быть определены путем вычисления процент Ki67+ BrdU+ ячейки среди всех ячеек BrdU+ (Рисунок 4A, C).
Наконец мы покажем пример immunolabeling задний мозг vibratome секций для RC2, антиген в нейронных конкретных промежуточного накаливания Нестин, чтобы визуализировать NPC endfeet (Рисунок 5B) и процессы (рис. 5 c). Vibratome секции, а не тонкие cryosections, позволяют улучшение наблюдения чрезвычайно разветвленной NPC, а также общей структуры нейроэпителиальных.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> Рисунок 1 : Ключевые шаги в рассечение задний мозг из эмбриона мыши e11.5. ( DA – ) Схематически microdissection задний мозг. (A) хвостовой головы ткани удаляется путем отсечения вдоль красной пунктирной линии. (B) плиты крыши пронзил и затем войной прочь в ростральной и хвостовой направлениях вдоль средней линии (вертикальной красной линии) и затем боково раскрыть neuroepithelium задний мозг. (C) neuroepithelium разжал от мозговых оболочек после вставки щипцы между обеими структурами, и тканей мозга и спинного мозга, удаляются по разрыву ткани с щипцами вдоль красной пунктирной линии. (D) Эта процедура дает плоский задний мозг. (KE–) Захват изображения из ключевых этапов в процедуре microdissection задний мозг. (E) эмбрион обезглавлен, разорвав вдоль пунктирной линии. (F) задний мозг и 4й желудочек, окруженная плиты крыши, вырезана и отделены от головы отсечения по пунктирным линиям. (G) 4й желудочек ориентирован вверх прежде чем небольшое отверстие является пронзили на знаке крыши (звездочка). Отверстие расширяется, пилинг ткани тщательно и рострально каудально вдоль средней линии (стрелки) подвергать задний мозг. Задний мозг это позиционируется сетчаточных стороной вниз и влево, чтобы сложить из в открытой книге подготовки (H; черная стрелка указывает задний мозг нервной ткани). Если задний мозг требуется для wholemount immunolabeling, сетчаточных мембрану удаляется, нежно выломав задний мозг neuroepithelium от окружающих менингеальные мембраны, с помощью щипцов, (я). Превышение среднего мозга (МБ) и спинного мозга (sc) ткани является удаленным (пунктирные линии в J) изолировать задний мозг (K). Линейки: 500 мкм (E), 300 мкм ( KF – ). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> Рисунок 2 : Wholemount immunolabeling может использоваться для количественного определения NPC митозов через задний мозг. (A) схемы, иллюстрирующие en лицом изображений митотическая РНУ в слое желудочков задний мозг. V, желудочковая задний мозг стороне; P, стороне сетчаточных задний мозг. (B) конфокальный плитка сканирования z стек задний мозг e10.5, после wholemount immunolabeling для pHH3 митотическая маркер (красный). Белый квадрат обозначает область показана на увеличение на второй панели в (D). (C) предварительно анафазе (белая стрелка) и митотические фигуры анафазе (черная стрелка) различимым в течение всего когорты митотическая РНУ. (D) время курс wholemount pHH3 маркировки от e9.5 13,5. Масштаб бары: 500 мкм (B); 20 мкм (C); 100 мкм в (D). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> Рисунок 3 : Велоспорт НИПы в пределах их зародышевые зоны в ростральной задний мозг. (A) схема, изображающих положение митотическая (зеленый) и S-фазы (красный) NPC на задний мозг желудочковой поверхности и в районе лейкомаляция, соответственно. В увеличение справа отображается виртуальный сечение через задний мозг. Черная стрелка указывает направление миграции NPC потомства, что вышли клеточного цикла к зоне дифференциации. (B) конфокальный z стек плавающей секции задний мозг e11.0 из эмбриона, который получил 1 h EdU импульса; immunolabeling для pHH3 и EdU был использован для визуализации митотическая (зеленый) и S-фазы (красный) НПС, соответственно. Задний мозг поверхности обозначаются пунктирными линиями; V, желудочковая задний мозг стороне; P, стороне сетчаточных задний мозг. Области, свидетельствует белая коробка показана на увеличение в вставкой; стрелки указывают плоскости спайности NPC в анафазе, по отношению к поверхности желудочков. (C) один канал отображения pHH3 immunolabeling только. Митотическая НИПы обозначаются голубой стрелок; Δ. (D) одноканальный отображение EdU маркировки только указывается отсутствие базальный отделы. Эду+ НПС принять псевдомногослойный распределения из-за их interkinetic ядерной миграции. Расстояние, на которое НИПы мигрируют от поверхности желудочков может быть измерена, как указал представитель оранжевой линией. Масштаб бары: 100 мкм (B -D); 10 мкм в врезные (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> Рисунок 4 : Объединение BrdU с Ki67 маркировки для определения способности самообновлению задний мозг NPC. (A) конфокальный z стек задний мозг cryosection e10.5 после маркировки для Ki67 (зеленый) и BrdU (красный) после 1 день BrdU пульс. Двойной положительных клеток в зоне желудочков, NPCs, которые включали BrdU и по-прежнему движутся через клеточный цикл, как указано Ki67 маркировки. Доля двойной меченых клетки среди всего населения BrdU+ представляет процент (самостоятельного обновления NPCB, C). Одноместный каналы Отображение Ki67 (B) и BrdU (C) immunolabeling только. BrdU+ клеток, что не хватает Ki67 и поэтому, вероятно, покинувшую клеточный цикл обозначается голубой стрелкой (A,C). Задний мозг поверхности обозначаются пунктирными линиями; V, желудочковая задний мозг стороне; P, стороне сетчаточных задний мозг. Линейки: 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> Рисунок 5 : Нестин immunolabeling визуализирует NPC процессов и endfeet. ( CA – ) Иммунофлюоресценции для RC2, который признает epitope на нейронных промежуточного накаливания Нестин, иллюстрирующий NPC морфология neuroepithelium задний мозг. (A) конфокальный z стек плавающей секции из e11.5 задний мозг после RC2 immunolabeling; в штучной упаковке районов показаны на увеличение в (B, B'; апикальной/желудочков региона) и (C, C'; базальной региона). Задний мозг поверхности обозначаются пунктирными линиями; V, желудочковая задний мозг стороне; P, стороне сетчаточных задний мозг. (B, C) Конфокальный z стеки в штучной упаковке районов (A); один оптический разделы отображаются в (B', C'), соответственно. NPC апикальной endfoot якорь на поверхности желудочков обозначается стрелкой (B). Одно- и fasciculated процессы NPC обозначаются белые и черные стрелки в (C'), соответственно. Масштаб бары: 100 мкм, (A); 25 мкм (B, C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis at JoVE.com

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Задний мозг мыши как модель для изучения эмбриональных нейрогенез

Эта статья демонстрирует, как мыши эмбриональные задний мозг может использоваться в качестве модели для изучения развития нейрогенез в целом органа и ткани секции подготовки.

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Маркировка и работы с изображениями Ячейки в задний мозг данио рерио

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Лектин изоляции, основанные на культуре и мышь мотонейронов Эмбриональные

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Методы изучения механизмов действия антипсихотических препаратов в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Роговицы Micropocket Анализ: Модель ангиогенеза в Mouse глаз

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Мышь Hindbrain<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Культура учиться на лице миграции Branchiomotor Neuron

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; In Vitro</em&gt; Взрослый мышь Muscle-нерв Подготовка к Изучая стрельбы Свойства Muscle афференты

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Обонятельная система как модель для изучения характера роста аксонов и морфология<em&gt; В Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Условный Генетическая Transsynaptic Трассировка в мозге эмбриональных мыши

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...